家蠶性別決定相關(guān)基因Bmhrp28和BmPSI的功能研究.pdf

1、性別決定是生物界基本的科學(xué)問(wèn)題之一。家蠶屬于鱗翅目昆蟲(chóng)，其性別決定機(jī)制與目前研究的最為清楚的模式昆蟲(chóng)果蠅相比，既有共同性，也有特殊性，因此家蠶性別決定機(jī)制的研究可為我們更好地理解昆蟲(chóng)性別決定提供一個(gè)新的模式。另外，其研究在產(chǎn)業(yè)上也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。家蠶泌絲結(jié)繭，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。家蠶為雌雄異體，而雄蠶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值顯著高于雌蠶。雄繭的平均出絲率要比雌繭高，并且雄蠶體質(zhì)強(qiáng)健、好養(yǎng)、飼料效率高、繭絲品質(zhì)好。因此，家蠶性別決定研究一直是蠶業(yè)的

2、重要課題。本研究利用家蠶的全基因組序列、表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)數(shù)據(jù)以及基因芯片數(shù)據(jù)，對(duì)Bmhrp28和BmPSI進(jìn)行了克隆和分析。同時(shí)采用了RT—PCR、原核表達(dá)、RNAi、酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)對(duì)Bmhrp28和BmPSI的功能進(jìn)行了研究。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道與GenBank登錄的Bmhrp28和BmPSI的基因序列，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行克隆，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證獲得兩個(gè)基因包括完整ORF序列的陽(yáng)性克隆

3、。在基因結(jié)構(gòu)上，Bmhrp28的ORF長(zhǎng)為771 bp，編碼256個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為28.2 kD，等電點(diǎn)為8.72，位于第21號(hào)染色體nscaf3044上，含有7個(gè)外顯子、6個(gè)內(nèi)含子。而B(niǎo)mPSI的ORF長(zhǎng)為2112bp，編碼703個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為76.4 kD，等電點(diǎn)為6.07，位于第20號(hào)染色體nscaf2789上，含有14個(gè)外顯子、13個(gè)內(nèi)含子。兩個(gè)基因的外顯子、內(nèi)含子邊界處均符合GT—AG規(guī)則

4、。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示，Bmhrp28和BmPSI所編碼蛋白均為RNA結(jié)合蛋白。Bmhrp28含有兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域，BmPSI含有四個(gè)KH結(jié)構(gòu)域和A、B兩個(gè)功能域。RRM和KH結(jié)構(gòu)域均為RNA結(jié)合的區(qū)域，此結(jié)構(gòu)域在RNA的選擇性剪接、加工、轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中發(fā)揮作用。Bmhrp28和BmPSI蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域部分與果蠅同源基因hrp48和PSI的結(jié)構(gòu)域部分相似性較高，在果蠅中hrp48和PSI作為調(diào)控因子參與P元件轉(zhuǎn)座酶的選擇性剪接。利用家蠶ES

5、Ts數(shù)據(jù)、全基因組芯片數(shù)據(jù)以及半定量RT—PCR方法進(jìn)行了表達(dá)譜分析。ESTs數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，Bmhrp28和BmPSI均具有EST證據(jù)。在家蠶卵巢細(xì)胞、胚胎、卵巢等組織器官中找到Bmhrp28的EST證據(jù)。在家蠶精巢、卵巢、絲腺、胚胎等組織器官中則具有BmPSI的EST證據(jù)。
　　 ⑵為了進(jìn)一步研究基因功能，我們將Bmhrp28和BmPSI分別連入經(jīng)改造的p28和pET—MBP表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá)。將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒命名

6、為Bmhrp28/p28和BmPSI/pET—MBP，并將其分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)菌株和Rosetta(DE3)表達(dá)菌株。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別得到了分子量約為31 kD和120 kD的重組蛋白，目的蛋白分子量約為28.2 kD和76.4 kD，加上6×His標(biāo)簽序列和MBP標(biāo)簽序列，大小約為31 kD和120 kD，與預(yù)測(cè)分子量相吻合。經(jīng)蛋白組分鑒定發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)的兩個(gè)重組蛋白均主要以可溶形式表達(dá)。通過(guò)親和層析和電洗脫的

7、方法分別純化原核表達(dá)的BmHRP28和BmPSI蛋白，將純化的蛋白免疫成年健康公兔，制備多克隆抗體。利用western blotting分析表明，BmHRP28和BmPSI的抗體是由其蛋白作為抗原而產(chǎn)生的，可以用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 ⑶采用體外合成短鏈siRNA介導(dǎo)RNAi的方式，利用家蠶限性白卵早期胚胎(雄)為材料，在產(chǎn)卵后48 h進(jìn)行顯微注射，后讓其繼續(xù)發(fā)育到96 h進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)在干擾Bmdsx上游基因Bmhrp28

8、和BmPSI后，Bmdsx下游基因PBP、SP1和Vg的表達(dá)差異，進(jìn)而對(duì)Bmhrp28和BmPSI在家蠶性別決定中的功能進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示，干擾BmPSI，下游基因PBP表達(dá)量降低，SP1和Vg表達(dá)量增加，暗示BmPSI作為Bmdsx上游調(diào)控因子在家蠶性別決定路徑中具有重要作用。而干擾Bmhrp28，下游基因PBP表達(dá)量雖然也有所降低，但SP1和Vg的表達(dá)量并未增加。我們推測(cè)Bmhrp28作為Bmdsx的上游調(diào)控因子雖然同樣參與了家

9、蠶性別決定路徑，但是功能可能弱于BmPSI。
　　 ⑷為確定Bmhrp28與BmPSI的相互關(guān)系，采用酵母雙雜交和免疫共沉淀的方法進(jìn)行研究。首先利用酵母雙雜交技術(shù)，在無(wú)自激活的前提下，將待檢測(cè)的目標(biāo)基因共轉(zhuǎn)酵母，通過(guò)檢測(cè)三個(gè)報(bào)告基因(HIS3、URA3、LacZ)是否表達(dá)從而確定目標(biāo)基因之間的相互關(guān)系。本研究中，首先將Bmhrp28連入pPC86載體(AD)，BmPSI連入pDBLeu載體(BD)。在檢測(cè)無(wú)自激活后，將pPC86

10、—Bmhrp28和pDBLeu—BmPSI共轉(zhuǎn)酵母。結(jié)果顯示，在SC/—Leu—Trp—His+3—AT平板與SC/—Leu—Trp—ura平板上均無(wú)可生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆，在LacZ膜檢中無(wú)顯藍(lán)色的陽(yáng)性結(jié)果，即HIS3、URA3、LacZ三個(gè)報(bào)告基因均未檢測(cè)到表達(dá)。由此可見(jiàn)Bmhrp28與BmPSI之間沒(méi)有直接相互作用或者相互作用極弱。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，我們采用免疫共沉淀檢測(cè)Bmhrp28與BmPSI之間的相互關(guān)系。首先以精巢組織抽提物

11、為材料，加入BmHRP28抗體去沉淀其抗原，與BmHRP28相互作用的其它蛋白也會(huì)一并沉淀下來(lái)，再用BmPSI抗體檢測(cè)沉淀蛋白產(chǎn)物中是否存在BmPSI。結(jié)果顯示，BmHRP28抗體沉淀的蛋白產(chǎn)物中，既存在BmHRP28，也存在BmPSI。結(jié)合之前酵母雙雜交的結(jié)果表明，Bmhrp28與BmPSI并不是直接相互作用，而是共存于一個(gè)蛋白復(fù)合體在家蠶性別決定路徑中行使功能。
　　 ⑸構(gòu)建了酵母雙雜交早期胚胎cDNA文庫(kù)。此文庫(kù)以家蠶限性

12、白卵品種(雄)為材料，將cDNA連入pDONR222載體，產(chǎn)生Gateway入門文庫(kù)。隨后將入門文庫(kù)轉(zhuǎn)到pDEST22載體上，獲得酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。經(jīng)鑒定，該文庫(kù)的總克隆數(shù)為1.36×107。從平板上隨機(jī)挑取40個(gè)轉(zhuǎn)化子菌落，提取文庫(kù)質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，該文庫(kù)插入的平均片段大小大于1.3 kb，重組率大于95％。取文庫(kù)1μL稀釋106倍后涂板檢測(cè)，共長(zhǎng)出77個(gè)菌落。擴(kuò)增后的文庫(kù)效價(jià)為7.7×1010cfu/mL。鑒

13、定結(jié)果表明，該文庫(kù)達(dá)到構(gòu)建文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)，可以用做下一步文庫(kù)的篩選。采用酵母雙雜交的方法，在無(wú)自激活的前提下，將pDBLeu—BmPSI篩選已構(gòu)建的家蠶酵母雙雜交早期胚胎cDNA文庫(kù)。菌落在SC/—Trp/—Leu/—His+30mM3—AT平板上生長(zhǎng)7天后，共長(zhǎng)出22個(gè)酵母轉(zhuǎn)化菌落。將酵母菌落在SC—Trp—Leu二缺平板上劃線保種，并挑取少量菌落檢測(cè)LacZ報(bào)告基因的表達(dá)。通過(guò)LacZ檢測(cè)的陽(yáng)性克隆在SC—Trp—Leu—Ura平板上劃