AfMNPV誘導(dǎo)凋亡SL-1細(xì)胞中凋亡體的研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞動(dòng)物中一種進(jìn)化上保守的，用來(lái)清除衰老損傷細(xì)胞的一種機(jī)制。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中凋亡信號(hào)通路的研究，已經(jīng)比較清楚，研究表明主要存在外源性信號(hào)通路和內(nèi)源性信號(hào)通路。其中在內(nèi)源性信號(hào)通路中，線粒體通過(guò)釋放像細(xì)胞色素C(cytochrome c)這樣的死亡因子來(lái)執(zhí)行細(xì)胞凋亡。cytochrome c一旦從線粒體中釋放出來(lái)便會(huì)同Apaf-1結(jié)合并在dATP的參與下募集procaspase-9(形成凋亡體)導(dǎo)致其活化，并引發(fā)隨后的效應(yīng)c

2、aspase活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中凋亡體起著重要的作用。
　　 我們以前的研究表明芹菜夜蛾核型多角體病毒(AfMNPV)能誘導(dǎo)鱗翅目斜紋夜蛾Sl-1細(xì)胞發(fā)生凋亡，并發(fā)現(xiàn)在凋亡過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)線粒體膜電位降低，cytochromec從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的現(xiàn)象，表明其凋亡信號(hào)通路同哺乳動(dòng)物線粒體信號(hào)通路相似。為了進(jìn)一步闡明AfMNPV或放線菌素D誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡的凋亡機(jī)制，本文對(duì)AfMNPV或放線菌素D在誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡過(guò)程中

3、，線粒體信號(hào)通路中組成凋亡體的各個(gè)組分進(jìn)行了初步探究。運(yùn)用western Blot技術(shù)檢測(cè)到了SL-1細(xì)胞中組成凋亡體的三種組分：Apaf-1，caspase-9和cytochrome c，運(yùn)用Co-IP技術(shù)發(fā)現(xiàn)了Apaf-1同caspase-9之間的相互作用，并測(cè)定了caspase酶活性等，初步探究了凋亡體的抑制劑5’對(duì)氟磺酰苯甲酰腺苷鹽酸鹽(FSBA)對(duì)桿狀病毒或放線菌素D誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡的影響。
　　 1、AfMNPV

4、或放線菌素D誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡過(guò)程中凋亡體各個(gè)組分的表達(dá)情況及caspase酶活性分析
　　 通過(guò)Western Blot結(jié)果顯示，AfMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡6h時(shí)細(xì)胞質(zhì)中Apaf-1的含量會(huì)升高，procaspase-9的含量由于活化而降低，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低；cytochrome c會(huì)從線粒體中釋放出來(lái)導(dǎo)致其含量升高。放線菌素D處理組的結(jié)果同AfMNPV類似，不同之處是procaspase-9會(huì)在處理后6h

5、表達(dá)量升高，隨后才下降。通過(guò)Co-IP技術(shù)可以檢測(cè)到在AfMNPV(或放線菌素D)誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡12h時(shí)Apaf-1和procaspase-9的相互作用。
　　 通過(guò)對(duì)SL-1細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase-9，caspase-3酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，AfMNPV(或放線菌素D)在誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡過(guò)程6h均能出現(xiàn)caspase-9，caspase-3活化的現(xiàn)象。caspase-9的酶活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢升高。AfMNPV

6、處理組的caspase-3酶活在18h時(shí)還有較高的酶活力，放線菌素D處理組caspase-3酶活則在6h和12h時(shí)較高。
　　 2.FSBA對(duì)AfMNPV或放線菌素D誘導(dǎo)的SL-1細(xì)胞凋亡的抑制作用
　　 FSBA是凋亡體抑制劑，細(xì)胞在最終濃度為50μM、100μM和200μM FSBA存在條件下，AfMNPV或放線菌素D誘導(dǎo)的SL-1細(xì)胞凋亡，細(xì)胞經(jīng)DAPI染色，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度的FSBA均能抑制桿狀病毒或放線菌