歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的原核表達與單克隆抗體的研制.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）于1987年在美國首次被發(fā)現(xiàn)，臨床主要表現(xiàn)為懷孕母豬的繁殖障礙和新生仔豬的呼吸道疾病。病原PRRSV屬尼多病毒目動脈炎病毒科，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PRRSV基因組大小約為15kb，含有9個開放閱讀框（ORFs），其中ORF7編碼的核衣殼蛋白（N蛋白）作為病毒粒子中含量最高、免疫原性最強的結(jié)構(gòu)蛋白之一，對

2、于PRRS的診斷及監(jiān)控防治具有重要意義。本研究選取歐洲型PRRSV SS-6毒株為研究對象，在克隆并鑒定該病毒N蛋白基因的基礎(chǔ)上，進行N蛋白的原核表達，并利用表達的重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體，為建立有效的歐洲型PRRSV檢測方法以及N蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1.歐洲型PRRSV N蛋白基因的克隆及原核表達
　　 根據(jù)GenBank中歐洲型PRRSV標準毒株（LV）ORF7基因序列設(shè)計了3條引物，且在其中兩

3、條引物上分別設(shè)計了EcoR I和Xho I酶切位點，以此引物擴增PRRSV SS-6毒株的N蛋白基因。將獲得的PCR產(chǎn)物用EcoR I和Xho I酶切后與經(jīng)同樣處理的pGEX-6p-1原核表達載體進行連接，轉(zhuǎn)化DH5a細胞后挑取陽性克隆。經(jīng)酶切鑒定和測序驗證后，將重組質(zhì)粒pGEX-N轉(zhuǎn)化至E.coli BL-21中，用IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE結(jié)果表明，重組質(zhì)粒在大腸桿菌中得到了高效表達，重組N蛋白分子量大小約為40kDa。

4、免疫印跡試驗結(jié)果顯示，以融合表達的重組N蛋白免疫小鼠制備的抗血清能夠與超速離心純化的歐洲型PRRSV發(fā)生特異性反應(yīng)，證明所表達的蛋白具有PRRSV抗原性。
　　 2.歐洲型PRRSV N蛋白單克隆抗體的制備
　　 取純化的重組GST-N蛋白免疫6～8周齡Balb/c小鼠，分離其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，用間接ELISA方法篩選陽性克隆，并采用有限稀釋法對其進行亞克隆，經(jīng)過3次亞克隆獲得1株能穩(wěn)定分泌抗N蛋白抗