豬白細胞介素-34(pIL-34)的分子克隆、表達和生物學活性驗證.pdf

1、白細胞介素是一類具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，對提高機體的免疫機能、抵抗病原感染具有積極作用。白細胞介素-34(IL-34)是2008年首次報道的一種新型白細胞介素，目前已知IL-34具有增強單核細胞活力、調(diào)節(jié)髓樣細胞生長分化、加速破骨細胞形成等生物學功能，對IL-34的理化特性、功能、作用機制、表達調(diào)控等方面的認識還極為有限。而有關(guān)豬IL-34的研究還暫未有文獻報道，鑒于此，本研究針對豬IL-34開展了基因克隆、表達及促進豬外周血單核

2、細胞增殖的活性等方面的研究，主要研究內(nèi)容包括：
　　 1.豬IL-34的克隆與序列分析根據(jù)與人IL-34mRNA序列具有高同源性的豬EST序列(CJ032290)設(shè)計引物pIL34-F/R，以poly(I:C)刺激的PK-15細胞的總RNA為模板，RT-PCR擴增獲得豬IL-34完整編碼區(qū)cDNA序列，并將其克隆至pMD18-T載體。測序結(jié)果顯示，克隆到的序列全長708bp，編碼235個氨基酸，該序列與豬EST數(shù)據(jù)庫中的參考序列

3、同源性為99.44％。根據(jù)ClustalW2序列比對結(jié)果，豬IL-34與人、牛、小鼠、大鼠IL-34氨基酸序列的同源性分別為：78％、85％、71％和71％。
　　 2.豬IL-34的組織差異表達分析以采自同一頭6周齡梅山豬的多種組織器官RNA為模板，半定量RT-PCR分別擴增目的基因IL-34和內(nèi)參基因GAPDH，分析豬IL-34在不同組織中的表達差異。結(jié)果表明豬IL-34mRNA在不同組織中的表達水平存在差異，其中以小腸中的

4、表達水平最高，其次為腦，在脾、肺、腎中的表達量較低，而在胃、肝和淋巴中幾乎沒有表達。
　　 3.豬IL-34的原核表達與多克隆抗體的制備PCR擴增去除豬IL-34完整編碼區(qū)前60個編碼信號肽的核苷酸的片段，插入原核表達載體pET-28a(+)中，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28-pIL34，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導，，SDS-PAGE檢測證實帶有6個組氨酸標簽的豬IL-34成熟肽融合蛋白能在大腸桿菌BL21中表達，表達產(chǎn)物大

5、小約為23kDa，并且主要以不溶性包涵體形式存在。進一步以抗6個組氨酸的單抗為一抗，通過Westernblot檢測證實了表達蛋白的特異性，隨后以表達產(chǎn)物為抗原免疫新西蘭兔制備了兔抗豬IL-34的多克隆抗體。
　　 4.豬IL-34的真核表達構(gòu)建了表達豬IL-34的真核表達質(zhì)粒pcDNA-pIL34，轉(zhuǎn)染CHO細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定表達豬IL-34的CHO細胞系。并采用RT-PCR和Westernblot從mRNA水平和蛋白質(zhì)