單基因疾病的分子診斷教材

1、分子診斷不僅能早期對疾病作出確切的診斷，也能 確定個體對疾病的易感性，判別致病基因攜帶者并 對疾病的分期、分型、療效監(jiān)測和預后作出判斷? 分子診斷已成為實驗診斷學的一個重要組成部分,第十三章 單基因疾病的分子診斷,,,,,分子診斷不僅廣泛應用于單基因疾病、多基因疾病、感染性疾病和腫瘤疾病的診斷中，而且在癥狀前診斷、產前診斷、植入前診斷等各時期的檢查中，以及在法醫(yī)學、移植配型、耐藥性研究、個性化治療和預防醫(yī)學檢驗中發(fā)揮著重

2、要作用。,分子診斷學的發(fā)展,第一代遺傳標志（RFLP）限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism） 在人類基因組中，不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內切酶識別位點上，酶切該DNA片段就會產生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。 由于DNA分子產生突變，使某些限制性酶切位點數增加、減少或移位，導致限制性酶切片段長度發(fā)生改變。,,RFLP的優(yōu)點：1）無表型效應

3、，其檢測不受環(huán)境和發(fā)育階段的影響。2） RFLP標記在等位基因之間是共顯性的，在配制雜交組合時不受雜交方式的影響。3）在非等位的RFLP標記之間不存在上位效應，因而互不干擾。4） RFLP標記源于基因組DNA的自身變異，在數量上幾乎不受限制。,,RFLP的缺點：1）酶切只能產生2-3個片段，可提供的信息量有限。2）有時需要用放射性同位素標記的DNA片段作為探針檢測RFLP。3） 無法克服RFLP多態(tài)信息含量低的缺陷。,分子診

4、斷學的發(fā)展,第二代遺傳標志（STR）短串聯重復序列（short tandem repeat） 人類基因組DNA有3×109bp，其中10%是串聯重復序列，稱為衛(wèi)星DNA（satellite DNA）?？煞譃榇笮l(wèi)星、中衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星。 重復單位由2-6bp組成的叫微衛(wèi)星，也稱它為短串聯重復序列。,,人類基因組DNA中平均每6-10kb就有一個STR位點，其多態(tài)性成為法醫(yī)物證檢驗、個人識別和親子鑒定的豐富信息

5、資源。STR標記主要位于非編碼區(qū)，變異一般不影響人體的結構與功能。靈敏度高，ng級DNA就可以有效擴增。適用生物檢材類型十分廣泛，對古代DNA也可檢測。,分子診斷學的發(fā)展,第三代遺傳標志（SNP）單核苷酸多態(tài)性(single nucletide polymorphism) 在基因組中，不同個體的DNA序列上的單個堿基的差異被稱為單核苷酸多態(tài)性。 基因型：一個人所擁有的一對等位位點的類型被稱為基因型。（genotype）

6、,,SNP的優(yōu)點：1）SNP在基因組中的分布廣泛。2）SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。3） SNP是高度穩(wěn)定的。4）部分位于基因內部的SNP可能會直接影響產物蛋白質的結構或基因表達水平。5）易于進行自動化、規(guī)模化分析，縮短了研究時間。,遺傳性疾?。河捎谌梭w的遺傳物質發(fā)生改變所引起的疾病。致病基因：能夠導致遺傳性疾病發(fā)生的基因。遺傳性疾病分為兩類：單基因病、多基因病。,單基因?。菏侵敢?/p>

7、種遺傳病的發(fā)生只受一對等位基因控制，他們的遺傳方式遵循孟德爾分離定律。多基因?。簝蓚€以上基因的結構或表達調控的改變，如糖尿病、高血壓、冠心病、骨質疏松癥等。,單基因疾病的三種遺傳方式,1. 常染色體遺傳（autosomal inheritance）包括：常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳。2. X連鎖遺傳（ X-linked inheritance）包括： X連鎖顯性遺傳和X連鎖隱性遺傳。3. 線粒體遺傳（mitochondria

8、l inheritance）,單基因疾病的三種遺傳方式,常染色體遺傳（autosomal inheritance）常染色體顯性遺傳疾病有Huntington病、脊髓小腦性共濟失調Ⅰ型等。 常染色體隱性遺傳疾病有鐮狀細胞貧血、苯丙酮酸尿癥和先天聾?、裥偷?。,單基因疾病的三種遺傳方式,2. X連鎖遺傳（ X-linked inheritance）X連鎖顯性遺傳有遺傳性腎炎、抗維生素D性佝僂病等。X連鎖隱性遺傳：假肥大性肌營養(yǎng)不良、

9、血友病、紅綠色盲等。,3 常見的線粒體疾病,肌陣攣性癲癇伴碎紅纖維病(MERRF)是一種線粒體腦肌病Leber遺傳性視神經病(LHON)是一種罕見的眼部線粒體疾病 帕金森?。≒D）,,,,分子診斷的策略,直接診斷基因多態(tài)性連鎖分析基因突變的定量診斷,,直接診斷：直接檢測導致遺傳性疾病的各種基因突變類型：點突變 缺失 插入 倍增前提：基因已

10、經克隆，序列和結構清楚,點突變,點突變：DNA分子中單個堿基的替換終止密碼子突變： 點突變導致提前產生終止密碼，或終止密碼突變而編碼一個氨基酸使肽鏈延長,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,各種點突變所造成的后果： 蛋白質分子量改變 蛋白質合成量下降 無蛋白質合成,,,,,(一)點突變的診斷1、 基因背景清楚的點突變等位基因特異性寡核苷酸雜交(allele spec

11、ific oligonucleotide, ASO)限制性片段長度多態(tài)性分析PCR-RFLP測序基因芯片技術,2、基因背景未知的點突變單鏈構象多態(tài)性(single-strand conformational polymorphism, SSCP)變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)異源雙鏈分析(heteroduplex analysis, HA)DN

12、A序列測定蛋白截短測試（protein truncation test, PTT）,片段性突變,核苷酸的丟失和增多缺失：基因中堿基（遺傳物質）的丟失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內部某一段序列發(fā)生重復,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,,(二)片段性突變的檢測片段性突變是指DNA分子較大范圍發(fā)生突變， 堿基的缺失、插入、擴增和重組。（1）少數核苷酸缺失或插入 檢測點突變的方法（2）大的片

13、段突變 Southern印跡技術、多重PCR技術。,動態(tài)性突變,以三核苷酸為單位的重復序列，在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的重復次數往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG重復。 少年脊髓型共濟失調：GAA重復。 ……,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,,二、基因多態(tài)性連鎖分析檢測原理：多態(tài)性連鎖分析、關聯分析檢測前提：致病基因尚未被定位和闡明

14、 基因太大、突變種類太多檢測方法：RFLP，STR，SNP,,三、基因突變的定量診斷檢測內容：大范圍的重復、缺失檢測方法：細胞分裂中期染色體檢測 固相雜交 PCR 擴增,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,1.直接診斷策略,2.間接診斷策略,,,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,1.直接診斷策略基因診斷的

15、直接策略就是通過各種分子生物學技術檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結構必須被闡明。 直接診斷是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.間接診斷策略,間接診斷的實質是在家系中進行連鎖分析，通 過分析可確定個體是否存在雙親同源染色體中 的致病染色體 間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過 分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性估計被檢者患病的 可能性,,,,

16、一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,連鎖分析(linkage analysis): 是通過用一系列覆蓋密度適當的遺傳標志在先證者家系中進行分析，從而找到與某一遺傳標志緊密連鎖的致病基因，并確定該基因在染色體上的位置。,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（三）基因診斷所采用的技術,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.基因表達異常的檢測,3.間接診斷所采用的技術,1.直接診斷所采用的技術,1.直接診斷所采用的技術,Southern 印

17、跡技術多重PCR技術PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）等位基因特異性寡核苷酸（ASO）DNA芯片技術（DNA chip）單鏈構象多態(tài)性（SSCP）變性梯度凝膠電泳（DGGE）DNA序列分析（DNA sequencing）,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.基因表達異常的檢測,定量PCR技術DNA結合染料技術水解探針技術雜交探針技術,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,3.間接診斷所采用的技術,

18、間接診斷就是分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性 （1）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） 第一代DNA的遺傳標志，具雙等位基因多態(tài)性，所含信息量有限 。 檢測方法：Southern印跡技術、PCR-RFLP。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,（2）小衛(wèi)星序列 串聯重復可變數目（VNTR），以 6～70bp 為單位，可重復數次至數十次，以串聯形式排列，構成數量可變的串聯重復序列。等位基因

19、常常達10個以上，信息量比 RFLP大得多 。 檢測方法：Southern 印跡技術、PCR技術 。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（3）微衛(wèi)星序列 以 2～6bp 為單位，重復次數可達幾十次，又稱短串聯重復序列(STR) ，在基因組中出現的數目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性，屬于第二代的遺傳學標志 。 檢測方法：PCR技術、基因掃描 。,,,,,,,一、單基

20、因遺傳性疾病的基因診斷,（4）單核苷酸多態(tài)性(SNP),第三代DNA的遺傳標志，其多態(tài)性僅表現為單個核苷酸的變異，在人類基因組中的數目可達300萬個，由3～4個相鄰的標志便可構成8～16種單倍型，是一種信息量非常大的標志系統 。 檢測方法：DNA芯片技術。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（四）遺傳標志的選擇,選擇離致病基因最近的遺傳標志 遺傳標志離致病基因的距離越遠，二者間發(fā)

21、生重組的可能性越大，二者間距離為1cM(106bp)時，發(fā)生重組的概率為1%,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（五）間接診斷的不確定性,遺傳標志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不夠完整,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,二、單基因病的分子診斷,單基因遺傳病 是由于某一基因結構的變化或由其而引起的基因表達異常而導致的疾病,,,,單基因疾病的分子診斷,一、血紅蛋白病二、血友病三、肌營養(yǎng)不良癥四、苯丙酮尿癥

22、五、亨廷頓病六、脆性X綜合征,血紅蛋白病,,單基因病的分子診斷,血紅蛋白病包括：鐮狀細胞貧血、地中海貧血,單基因病的分子診斷,,,Southern blot,分子診斷,,,（一）血友病A的分子診斷（二）珠蛋白合成障礙性貧血的分子診斷,,,,二、單基因病的分子診斷,二、單基因病的分子診斷,1.凝血因子Ⅷ基因的主要遺傳缺陷,2.FⅧ基因的直接檢測（22號內含子倒位檢測）,3.FⅧ基因連鎖分析（FⅧ基因st14位點多態(tài)性檢測）,,,,（一

23、）血友病A的分子診斷,血友病A,1. 凝血因子Ⅷ基因的主要遺傳缺陷 主要為點突變和基因缺失 缺失 169 種 插入 28 種 點突變 347 種 第22號內含子倒位:40%～50%重型HA,二、單基因病的分子診斷,,,,,,第22號內含子倒位的機制,二、單基因病的分子診斷,,,,11kb/,12kb/,12kb/,11kb/12kb,2. FⅧ基因的直接檢測——

24、22號內含子倒位檢測,二、單基因病的分子診斷,長距離PCR擴增22號內含子,,,,3. FⅧ基因連鎖分析—— FⅧ基因st14位點多態(tài)性檢測,B/,A/,B/C,B/C,C/D,C/,B/D,二、單基因病的分子診斷,PCR檢測VNTR （st14）位點進行家系連鎖分析,,,,血紅蛋白異常包括兩大類 結構變異：珠蛋白鏈上氨基酸序列發(fā)生改 變如鐮狀細胞貧血 珠蛋白鏈合成障礙：一部分珠蛋白鏈合成過多， 一部分珠蛋白鏈合成過少甚

25、至不能合成，如地中 海貧血,二、單基因病的分子診斷,（二）珠蛋白合成障礙性貧血的分子診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（一）單基因疾病中常見的分子異常,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,（三）基因診斷所采用的技術,（四）遺傳標志的選擇,（五）間接診斷的局限,,,,（一）單基因疾病中常見的分子異常,由于一個（或數個）基因發(fā)生異常導致這些基因所載有的遺傳信息改變 基因突變主要包括三大類： 點突變、片段性突變和動態(tài)性突

26、變,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,1.點突變,2.片段性突變,3.動態(tài)性突變,,,,1.點突變,點突變：DNA分子中單個堿基的替換終止密碼子突變： 點突變導致提前產生終止密碼，或終止密碼突變而編碼一個氨基酸使肽鏈延長,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,各種點突變所造成的后果： 蛋白質分子量改變 蛋白質合成量下降 無蛋白質合成,,,

27、,2.片段性突變,核苷酸的丟失和增多缺失：基因中堿基（遺傳物質）的丟失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內部某一段序列發(fā)生重復,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,3.動態(tài)性突變,以三核苷酸為單位的重復序列，在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的重復次數往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG重復。 少年脊髓型共濟失調：GAA重復。 ……,一、單基因遺傳性疾病的基因診

28、斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,1.直接診斷策略,2.間接診斷策略,,,,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,1.直接診斷策略 基因診斷的直接策略就是通過各種分子生物學技術檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結構必須被闡明。 直接診斷是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.間接診斷策略,間接診斷的實質是在家系中進行連鎖分

29、析，通 過分析可確定個體是否存在雙親同源染色體中 的致病染色體 間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過 分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性估計被檢者患病的 可能性,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,連鎖分析(linkage analysis): 是通過用一系列覆蓋密度適當的遺傳標志在先證者家系中進行分析，從而找到與某一遺傳標志緊密連鎖的致病基因，并確定該基因在染色體上的位置,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（三

30、）基因診斷所采用的技術,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.基因表達異常的檢測,3.間接診斷所采用的技術,1.直接診斷所采用的技術,1.直接診斷所采用的技術,Southern 印跡技術多重PCR技術PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）等位基因特異性寡核苷酸（ASO）DNA芯片技術（DNA chip）單鏈構象多態(tài)性（SSCP）變性梯度凝膠電泳（DGGE）DNA序列分析（DNA sequencing）,,,,

31、一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.基因表達異常的檢測,定量PCR技術DNA結合染料技術水解探針技術技術雜交探針技術,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,3.間接診斷所采用的技術,間接診斷就是分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性 （1）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） 第一代DNA的遺傳標志，具雙等位基因多態(tài)性，所含信息量有限 。 檢測方法：Southern印跡技術、PCR-RFLP。,一、單

32、基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,（2）小衛(wèi)星序列 串聯重復可變數目（VNTR），以 6～70bp 為單位，可重復數次至數十次，以串聯形式排列，構成數量可變的串聯重復序列。等位基因常常達10個以上，信息量比 RFLP大得多 。 檢測方法：Southern 印跡技術、PCR技術 。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（3）微衛(wèi)星序列 以 2～6bp 為單位，重復次數可達幾

33、十次，又稱短串聯重復序列(STR) ，在基因組中出現的數目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性，屬于第二代的遺傳學標志 。 檢測方法：PCR技術、基因掃描 。,,,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（4）單核苷酸多態(tài)性(SNP),第三代DNA的遺傳標志，其多態(tài)性僅表現為單個核苷酸的變異，在人類基因組中的數目可達300萬個，由3～4個相鄰的標志便可構成8～16種單倍型，是一種信息量非常大的標志系統 。 檢測方法：

34、DNA芯片技術。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（四）遺傳標志的選擇,選擇離致病基因最近的遺傳標志 遺傳標志離致病基因的距離越遠，二者間發(fā)生重組的可能性越大，二者間距離為1cM(106bp)時，發(fā)生重組的概率為1%,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（五）間接診斷的不確定性,遺傳標志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不夠完整,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,二、單基因病

35、的分子診斷,單基因遺傳病 是由于某一基因結構的變化或由其而引起的基因表達異常而導致的疾病,,,,（一）血友病A的分子診斷（二）珠蛋白合成障礙性貧血的分子診斷,,,,二、單基因病的分子診斷,二、單基因病的分子診斷,1.凝血因子Ⅷ基因的主要遺傳缺陷,2.FⅧ基因的直接檢測（22號內含子倒位檢測）,3.FⅧ基因連鎖分析（FⅧ基因st14位點多態(tài)性檢測）,,,,（一）血友病A的分子診斷,血友病A,1. 凝血因子Ⅷ基因的主要遺傳缺陷

36、 主要為點突變和基因缺失 缺失 169 種 插入 28 種 點突變 347 種 第22號內含子倒位:40%～50%重型HA,二、單基因病的分子診斷,,,,,,第22號內含子倒位的機制,二、單基因病的分子診斷,,,,11kb/,12kb/,12kb/,11kb/12kb,2. FⅧ基因的直接檢測——22號內含子倒位檢測,二、單基因病的分子診斷,長距離PCR擴增22號內

37、含子,,,,3. FⅧ基因連鎖分析—— FⅧ基因st14位點多態(tài)性檢測,B/,A/,B/C,B/C,C/D,C/,B/D,二、單基因病的分子診斷,PCR檢測VNTR （st14）位點進行家系連鎖分析,,,,血紅蛋白異常包括兩大類 結構變異：珠蛋白鏈上氨基酸序列發(fā)生改 變如鐮狀細胞貧血 珠蛋白鏈合成障礙：一部分珠蛋白鏈合成過多， 一部分珠蛋白鏈合成過少甚至不能合成，如地中 海貧血,二、單基因病的分子診斷,（二）珠蛋白

38、合成障礙性貧血的分子診斷,,,,珠蛋白合成障礙性貧血的遺傳缺陷 （1）α珠蛋白合成障礙性貧血 主要基因缺陷：α珠蛋白基因缺失 檢測方法：Southern印跡技術、PCR,二、單基因病的分子診斷,,,,,,,α0珠蛋白合成障礙性貧血（α0--SEA型）基因缺失檢測引物部位,,,,二、單基因病的分子診斷,（2）β珠蛋白合成障礙性貧血 基因缺陷：點突變和移碼突變 檢測方法：基因