體外診斷試劑生產質量控制要點

1、體外診斷試劑生產和質量控制要點,主講人:顧燕黎 上?？迫A生物工程股份有限公司,體外診斷試劑產品介紹,一酶聯(lián)免疫診斷試劑產品乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）二快速診斷試劑產品人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒（膠體金法）三PCR核酸診斷試劑產品乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）四臨床化學診斷試劑產品葡萄糖試劑盒（液體單試劑）（氧化酶法）,一.酶聯(lián)免疫診斷試劑產品,【產品名稱】

2、乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）【包裝規(guī)格】 96人份/盒【預期用途】 本試劑盒采用酶聯(lián)免疫法原理檢測HBsAg，適用于血清或血漿類標本。,酶聯(lián)免疫法反應原理,雙抗體夾心法,雙抗原夾心法,,抗-HBs,抗-HBs-HRP,HBsAg,乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）的原理,采用抗-HBs包被反應板，加入待測樣本，經孵育后，加入抗-HBs-HRP，當樣本中存在HBsAg時，該HBsAg與包被

3、抗-HBs結合并與抗-HBs-HRP結合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP復合物，加入TMB底物產生顯色反應，反之則無顯色反應。,試劑盒組份,主要生產設備,生產工藝流程圖,,,合并,分裝,純化,包被,結酶,純化,配制,配制,配制,,,,,,,抗-HBs血清,酶標用抗-HBs,抗-HBs-HRP,酶結合物,反應板,包板用單抗-HBs,單抗-HBs腹水,正常人血清、陽性血,陰、陽性對照,顯色劑、終止液、洗滌液,TMB、硫酸、吐溫

4、20,成品,半成品,滴配,半成品檢定,成品檢定,,,,,,,,,,外購原輔料控制,原輔料必須從合格供應商目錄所載廠家購入。采購的生產用原輔料，均應符合藥品的標準、包裝材料標準、生物制品規(guī)程或其它標準，不得對產品的質量產生不良影響。,自制主要原料生產和質量控制要點,工藝用水 抗原 抗體 酶標記物,基因工程HBsAg生產和質量控制要點,基因工程HBsAg質量標準,效價： ELISA純度：采用

5、SDS-PAGE功能性實驗 ：陰性對照、陽性對照、陰性參考品符合率、最低檢出量、精密性、穩(wěn)定性蛋白濃度：用雙縮脲法測定,單抗-HBs生產和質量控制要點,單抗-HBs質量標準,純度 ：采用SDS-PAGE法蛋白含量 ：采用Lowry法效價 ：ELISA效價功能性檢測：免疫活性、穩(wěn)定性,多抗-HBs生產和質量控制要點,多抗-HBs的質量標準,純度 ：SDS-PAGE法檢定蛋白含量 ：Lowry法效價 ：對流電泳法測定效價功能

6、性檢測：免疫活性、穩(wěn)定性,多抗-HBs-HRP生產和質量控制要點,辣根過氧化物酶質量標準,溶解性 ：應符合要求PH值 ：應符合要求活性測定 ：應符合要求RZ值：應≥3.0,多抗-HBs-HRP質量標準,免疫活性穩(wěn)定性試驗,反應板制備生產和質量控制要點,反應板制備,包被液配制質量控制點：包被緩沖液pH 測定方法：用pH計測定,反應板制備,反應板的包被質量控制點：包被液量的準確性 要求：100μl/孔

7、操作： 將待包被的微孔反應板放置傳送帶上，開始包被，每塊包被板應用目測法檢查其96孔加液是否完整。前10塊包被板檢查加液量是否準確，檢后的包被板放入報廢專用盤內，作報廢處理。 連續(xù)100塊包被板檢查合格后，進入正常包被過程。正常包被過程中每100塊包被板應抽1塊作過程檢查。,反應板制備,反應板的包被質量控制點： 反應板包被放置的溫度及時間的控制

8、 要求： 2-8℃冷庫包被過夜。 操作：包被板應堆放整齊，并用一次性塑料布覆蓋。注明產品名稱、批號和時間，放入2-8℃冷庫包被過夜。,反應板制備,反應板的洗滌、加封閉液質量控制點：液量的準確性 要求: 洗板液量：200μl/孔 封閉液量：250μl/孔,反應板制備,反應板的封閉質量控制點： 封閉溫度：37±0.5℃

9、 封閉時間：2小時 操作：將加好封閉液的包被板整齊堆放在托盤內，注明批號、封閉開始時間和結束時間，放入恒溫房。到達規(guī)定時間后，迅速取出包被板，轉入下一道工序的生產。,反應板制備,反應板的抽干質量控制點：抽干機的真空度、溫度 要求： 真空度：低于100Pa，維持4小時以上 溫度：20±2℃,反應板制備,鋁箔袋

10、的熱封質量控制點： 房間的濕度：＜40% 鋁箔袋的密封性： 端面刀封溫度210±5℃ 中封刀封溫度210±5℃ 操作： 房間濕度控制：生產操作前提前2小時，打開去濕機進行工作場地去濕，使車間濕度達到

11、40%以下。 鋁箔袋的密封性：在線袋袋檢。,反應板制備,反應板的抽檢質量標準：陰性參考品符合率：用國家參考品或國家參考品標化的參考品進行檢定，不得出現(xiàn)假陽性。陽性參考品符合率：用國家參考品或國家參考品標化的參考品進行檢定，不得出現(xiàn)假陰性。 最低檢出量：用國家參考品或國家參考品標化的參考品進行檢定， HBsAg adr、adw及ay亞型的最低檢出量應符合要求。 精密性：用國家參考品或國

12、家參考品標化的參考品進行檢定，CV（%）應不高于15%（n=10）。,陰、陽性對照制備的生產和質量控制要點,陰、陽性血清的滅活,要求： 滅活時間：1小時 溫度：60℃操作：將血清置水浴箱內。隨時注意測量血清溫度，當血清溫度到達60℃時，開始計時至規(guī)定時間止。,陰、陽性對照的配制控制,陰性對照的配制質控點：陰性對照OD值要求：OD值≤0.050 陽性對照的配制質控點：陽性

13、對照OD值要求：OD值≥1.000,通用試劑制備的生產和質量控制要點,顯色劑B的配制,質量控制點： 1 溶液配制的準確性 用pH計測定溶液pH值應符合要求 用電導率儀測定溶液電導率應符合要求 2 配制、分裝環(huán)境：避光 3 配制后溶液分裝的即時性：12小時內進行分裝,顯色劑A的配制,質量控制點： 1溶液配制的準確性

14、 用pH計測定溶液pH值 用電導率儀測定溶液電導率 2配制后溶液存放：72小時內進行分裝,終止液的配制,質量控制點： 溶液配制的準確性： 用婆美計測定溶液的比重應符合要求,洗滌液的配制,質量控制點： 溶液配制的準確性 用pH計測定溶液pH值 用電導率儀測定溶液電導

15、率,酶結合物制備生產和質量控制要點,半成品檢定質量標準,物理檢查 試劑空白陰性對照陽性對照 陰性參考品符合率陽性參考品符合率最低檢出量精密性穩(wěn)定性實驗 :,試劑的分裝、貼簽生產和質量控制要點,除菌過濾質量控制點：過濾膜的起泡點實驗要求：濾器滅菌121℃30分鐘；0.22μm濾芯泡點≥3.5bar,分裝,質量控制點：液量的準確性、試劑瓶的密封性 要求： 分裝

16、液量應大于等于標示量 ； 分裝好的試劑瓶應無漏液現(xiàn)象。,貼簽,質量控制點：批號打印的準確性 要求：批號等打印正確、清晰操作： 貼瓶開始后，前30瓶應仔細檢查瓶貼質量，包括瓶貼位置，批號等打印是否正確、清晰，粘貼是否牢固、平整等。 合格后，每50瓶抽1瓶進行檢查。,合并包裝生產和質量控制要點,成品檢定質量標準,物理檢查 試劑空白陰性對照陽性對照陰性參考品符合

17、率陽性參考品符合率最低檢出量精密性穩(wěn)定性實驗,成品入庫,入庫控制點：產品放行報告；入庫數要求： 憑由質量管理部經理簽署的成品出廠合格報告，成品檢定書辦理入庫手續(xù)，入庫數應與成品出廠合格報告中所報數量一致。,P2生物安全實驗室管理,人員衛(wèi)生 進入P2實驗室必須加穿潔凈防護服，帶一次性乳膠手套和一次性口罩。只允許工作人員進入，禁止非工作人員進入實驗室。生物安全柜 實驗室的操作嚴格按操

18、作規(guī)程進行操作，對存在感染性或潛在感染性的操作須在生物安全柜內進行。做好相應的消毒、使用記錄。消毒及滅菌 所有直接或間接接觸病原微生物的儀器、設備、器具，均需進行消毒處理，能高壓的選擇121℃高壓滅菌30分鐘處理，不能高壓的選擇1%次氯酸鈉消毒。實驗中產生的具有感染性或潛在感染性的穿透性利器廢物置入黃色塑料利器盒中，其他非利器廢物置入黃色醫(yī)療廢物塑料袋中。 實驗室應指定專人負責感染性或存在潛在感染性材料的保藏，做好標識

19、，建立臺帳。,二.金標產品,【產品名稱】人類免疫缺陷病毒(HIV1/2)抗體診斷試劑盒(膠體金法)【包裝規(guī)格】 50人份/盒【預期用途】本試劑盒適用于對人血清/血漿或全血中的(HIV1/2)抗體的快速檢測。,金標產品檢驗原理,本品采用膠體金免疫層析技術，在玻璃纖維膜上預包被金標記HIVgp160和gp36抗原等，在硝酸纖維膜檢測線和質控線上分別包被HIVgp41、gp36混合抗原和抗體等，當檢測進行時，樣品中HIV抗體可與

20、金標記HIV抗原結合形成復合物，由于層析作用復合物沿試紙條向前移動。 若樣品中含有可被檢測的HIV抗體，則與檢測線預包被的HIV抗原結合形成“金標記HIV抗原—HIV抗體—HIV包被抗原”復合物而凝聚顯色；若樣品中沒有HIV抗體或HIV抗體的含量低于檢測限時，則不形成復合物而不顯色。,主要組成成份,HIV(1/2)抗體膠體金試紙條/板 50 Tests 樣品稀釋液（磷酸鹽緩沖液） 1瓶

21、5;4.0ml/瓶說明書1份,金標產品主要生產設備,金標產品生產工藝流程圖,氯化金,,膠體金,標記抗原HIVgp36HIVgp160,,,,,金標記抗原,,金反應墊,燒金,標金,噴金,干燥,包被抗原HIVgp36A抗原,,檢測線包被液,抗HIVgp160單抗,,質控線包被液,配制,配制,,,,,反應膜,劃膜,干燥,,,,,試紙大板,組裝,試紙條,切割,試紙板,封裝,氯化鈉等,,配制,樣品稀釋液,,,待檢成品,合并,,出廠

22、成品,檢定,滴配,滴配,,,,檢定,半成品檢定,半成品檢定,成品檢定,分裝、帖簽,,物料,質控點,工序,關鍵工序,gp160抗原制備的生產和質量控制,,gp160抗原質量標準,物理性狀：為澄清溶液 純度：采用SDS-PAGE分子量 ：免疫活性穩(wěn)定性,gp36抗原制備的生產和質量控制,gp36抗原質量標準,純度分子量 功能性試驗 穩(wěn)定性,gp41抗原制備的生產和質量控制,,gp41抗原質量標準,純度：采用SDS-PAGE法檢定

23、應符合要求分子量 功能性試驗 穩(wěn)定性,抗HIV單抗制備的生產和質量控制,,單抗質量標準,純度 分子量 功能性檢測穩(wěn)定性試驗：37℃放置15天，檢測上述標本，可達到上述功能性檢測標準。,金反應墊制備的生產和質量控制要點,金反應墊的制備,膠體金的制備控制點：膠體金顏色、波長的控制要求： 膠體金顏色：紅色； 波長：528±4nm,金反應墊的制備,金標抗原的制

24、備質量控制點：GP160和GP36抗原標記時 pH值、顏色、波長的控制要求：用PH計測定，pH值：6-7； 顏色：紅色 波長：533±4nm,金反應墊的制備,滴 配質量控制點：金標抗原的靈敏度和特異性要求：通過HIV快速診斷試劑國家參考品測定方法：適當地調整兩種金標抗原的濃度和比例，比較靈敏度和特異性結果，確定最佳的工作濃度。用HIV快速診斷

25、試劑國家參考品檢驗，應符合要求。,金反應墊的制備,噴 金質量控制點：包被液量的準確性 要求：2μl/mm 方法： 將待包被的玻璃纖維放置于面板，開始包被，每張玻璃纖維應用目測法檢查加液是否完整。連續(xù)5張玻璃纖維檢查合格后，進入正常包被過程。正常包被過程中每100張金反應墊應抽1張作過程檢查。,金反應墊的制備,金反應墊的抽干質量控制點：真空度、時間的控制要求：

26、 真空度：低于100Pa 時間：維持2小時以上,,金反應墊的保存質量控制點：金反應墊的存放要求：避光、干燥（濕度＜30% ）操作： 用目測法檢測保存金反應墊的鋁箔袋的密封性。 存放金反應墊的干燥柜 每天監(jiān)測濕度2次。,金反應墊的制備,金反應膜制備生產和質量控制要點,金反應膜制備,質控線包被液的配制控制點： 包被緩沖液pH值及包被濃度要求： 包被緩沖

27、液pH值：用pH計測定 包被濃度：用核酸蛋白儀檢測其蛋白濃度應符合要求,金反應膜制備,檢測線包被液的配制質量控制點： 包被緩沖液pH值及包被濃度要求： 包被緩沖液pH值：pH計測定 包被濃度：用核酸蛋白儀檢測其蛋白濃度應符合要求,金反應膜制備,包被抗原滴配控制點：包被抗原滴配的靈敏度和特異性要求：通過HIV快速診斷試劑國家參考品測定方法：適當地調整抗原的濃度和比例，比較靈敏度和特異性結果，確定最佳

28、的工作濃度。用國家參考品檢驗，應符合要求。,金反應膜制備,劃膜包被控制點：點樣量、質控線及檢測線間距要求：點樣量0.5-1.5μl/mm ；兩線間距5-6.5mm操作： 將待包被的硝酸纖維素膜放置于軌道，用卡尺檢測質控線和檢測線出樣管的間距，符合要求后開始包被。觀察包被液體出樣情況，連續(xù)5分鐘無異常，則進入正常包被過程。正常包被過程中每卷金反應膜抽1張進行檢查。,金反應膜制備,金反應膜的抽干質量控制點

29、：真空度、時間的控制要求： 真空度：低于100Pa 時間：維持2小時以上,金反應膜制備,金反應膜的保存控制點：金反應膜存放要求：避光、干燥（濕度＜30% ）操作： 用目測法檢測保存金反應膜的鋁箔袋的密封性。 存放金反應膜的干燥柜 每天監(jiān)測濕度2次。,樣品稀釋液制備生產和質量控制要點,樣品稀釋液的配制質量控制點： pH值要求：用pH計進行測量,試紙大板

30、的組裝及分裝生產和質量控制要點,試紙大板的組裝及分裝,試紙大板的裝配質量控制點： 加樣墊、金反應墊、金反應膜、吸水紙等各組分應銜接緊密,試紙大板的組裝及分裝,試紙條的切割質量控制點：試紙條切割寬度 要求：300±2mm*8mm,試紙大板的組裝及分裝,CT盒的組裝質量控制點：應檢查試紙條的完整性,試紙大板的組裝及分裝控制,裝鋁箔袋質量控制點： 鋁箔袋應密封,樣品稀釋液

31、的配制、分裝及貼簽,合并包裝的生產和質量控制要點,質量控制點：1.包裝盒的批號打印準確、清晰。2.合并組分的齊全性，物料的損耗是否符合規(guī)定要求。,成品檢驗質量標準,外觀 ：試紙條外觀平整，材料附著牢固。每條寬不小于3mm。 物理檢查：膜面無破損、劃痕。 陰性參考品符合率 ：應符合要求陽性參考品符合率 ：應符合要求最低檢出限參考品符合率：應符合要求精密性試驗：應符合要求濾血功能：應符合要求穩(wěn)定性試驗：試劑盒各組分置37℃

32、15天 ，應符合性能要求。,三.PCR核酸診斷試劑產品,【產品名稱】乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）【包裝規(guī)格】 32人份/盒【預期用途】 本試劑盒采用PCR技術、實時熒光探針技術、用于對臨床血清或血漿標本中的乙型肝炎病毒核酸DNA的定量檢測。,PCR診斷試劑的原理,本品系由乙型肝炎病毒特異性引物、熒光探針、以及Taq酶等成分組成，采用PCR體外擴增的方法，用過熒光信號的變化，定量檢

33、測人血清或血漿標本中的HBV DNA。,【試劑盒組份】,生產工藝流程圖,PCR產品生產和質量控制要點,工作標準品的定標,根據測定的HBV質粒含量，取適量HBV質粒用模擬血清稀釋后，以質控參考品為標準進行標定，使最終稀釋濃度為約107Copies/ml，即為工作標準品①。 然后將工作標準品①進行10倍系列梯度稀釋，稀釋后為工作標準品②、工作標準品③、工作標準品④。,質量標準,陰性對照：陰性對照的檢測結果應為陰性，工作標準品：

34、 工作標準品Q1～Q4的測定值符合下表的范圍，并且其線性相關系數|r|≥0.950。工作標準品 已知拷貝數（IU/ml） 拷貝數允許范圍（IU/ml）Q1（工作標準品①）K1×1073.54K1×106～2.83K1×107Q2（工作標準品②）K2×1063.54K2×105～2.83K2×106Q3（工作標準品③）K3&

35、#215;1053.54K3×104～2.83K3×105Q4（工作標準品④）K4×1043.54K4×103～2.83K4×104陰性參考品符合率：檢測國家標準品，對8份陰性參考品檢測結果不得出現(xiàn)假陽性。陽性參考品符合率：檢測國家標準品，對9份陽性參考品檢測結果不得出現(xiàn)假陰性。最低檢出限：檢測國家標準品中，線性和靈敏度參考品L0~L5必須檢出，L6僅供參

36、考。與標準值的線性回歸系數R≥97.0%。精密性：測定公司工作標準品10次，定量結果的變異CV≤10%。若以Ct計算，CV值小于15％（n＝10）。,四.臨床化學診斷試劑產品,【產品名稱】葡萄糖試劑盒（氧化酶法）【預期用途】 本試劑盒用以測定人血清中葡萄糖的含量。,生化產品的包裝規(guī)格,葡萄糖試劑盒（氧化酶法）的檢測原理,葡萄糖+O2+H2O,葡萄糖酸+H2O2,H2O2+苯酚+4-氨基安替比林,,醌亞胺+H2O