萍鄉(xiāng)紅鯽卵母細胞組化及ZP(zona pellucida)基因的分子特征和表達分析.pdf

1、萍鄉(xiāng)紅鯽( Pingxiang red-transparent crucian carp, Carassius auratus var.Pingxiangnensis,簡寫CaP),分布于中國江西省萍鄉(xiāng)地區(qū),是一種自然野生的三倍體鯽魚突變體,具有雌核發(fā)育和兩性生殖兩種方式。關(guān)于萍鄉(xiāng)紅鯽卵膜透明帶基因(Zona Pellucida genes of CaP,CaP_ZP)表達和調(diào)控的研究很少。本研究包括以下四個部分:
　　一,應(yīng)用細

2、胞化學(xué)方法研究了萍鄉(xiāng)紅鯽卵子發(fā)生過程中主要生物大分子的變化。從1時相卵母細胞發(fā)育到2時相卵母細胞,可見蛋白質(zhì)沉積。但過碘酸-雪夫反應(yīng)(Periodic acid Schiff,PAS反應(yīng))和蘇丹黑反應(yīng)為陰性。隨著卵母細胞的繼續(xù)發(fā)育,糖類和脂類在卵母細胞質(zhì)中出現(xiàn)。結(jié)果顯示,成熟卵母細胞包含了大量蛋白質(zhì)、糖類和脂類,為成功受精以及胚胎發(fā)育作好準(zhǔn)備。
　　二,利用蔗糖-尿素法來分離純化萍鄉(xiāng)紅鯽卵母細胞卵殼蛋白,SDS-PAGE膠分析顯示

3、位于40-70kDa的四條卵膜蛋白條帶分子量大小與已經(jīng)獲得的萍鄉(xiāng)紅鯽CaP_ZP2和CaP_ZP3基因cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸是相符的。利用RACE-PCR的方法,從萍鄉(xiāng)紅鯽卵巢組織中,克隆出了CaP_ZP2基因cDNA全長1682bp,包含了一個1584bp的開放閱讀框,編碼527個氨基酸殘基。采用染色體步移方法,成簇的編碼CaP_ZP蛋白的三個CaP_ZP基因被克隆鑒定出。這三個CaP_ZP基因,CaP_ZP3.1,CaP_ZP2和

4、CaP_ZP3.2,位于一個10,855bp區(qū)域之內(nèi)。這三個CaP_ZP基因都包含8個外顯子和7個內(nèi)含子,外顯子長度分別為1348bp,1638bp和1348bp。這三個CaP_ZP基因的外顯子和內(nèi)含子的基因組結(jié)構(gòu)是完全相同的,暗示這三個ZP基因可能來自共同的基因祖先。
　　三,本研究利用熒光定量PCR的方法,檢測了萍鄉(xiāng)紅鯽CaP_ZP2基因mRNA在心臟,肝臟,脾臟,腎臟,大腦和卵巢組織中的差異性表達。結(jié)果表明:CaP_ZP2基

5、因在肝臟中的表達量最低,卵巢組織中的表達量最高。卵巢中CaP_ZP2基因的表達水平大約是肝臟中的85,932倍。其他組織中,CaP_ZP2基因僅有微量的表達。利用熒光定量PCR技術(shù),進一步檢測了CaP_ZP2和CaP_ZP3基因mRNA在卵巢組織不同發(fā)育階段中差異性表達。分析結(jié)果顯示,兩個CaP_ZP基因在4-8月齡早期發(fā)育的卵巢中表達水平較高,在9-12月齡晚期的卵巢中,表達水平急劇降低。原位雜交實驗也證實CaP_ZP2基因在卵母細胞

6、發(fā)育的早期檢測到較強的雜交信號,發(fā)育晚期雜交信號減弱。在卵巢發(fā)育的不同時期,這兩個基因具有相同的表達模式。
　　四、一段特殊的1097bp啟動子序列被克隆,該序列是CaP_ZP2和CaP_ZP3.2基因的共用啟動子序列。將該啟動子序列從順反方向上插入到修飾的pAcGFP1-1載體中。質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染cos-7細胞系。在cos-7細胞中觀察到較強的GFP熒光信號。由此,我們鑒定出了一段特殊的啟動子序列,該序列利用順反方向上相同的調(diào)控元件