超聲預(yù)處理影響金槍魚皮膠原ACE抑制肽釋放機(jī)制及其酶解液消化穩(wěn)定性的研究.pdf

1、金槍魚是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類，在全世界有很高的漁獲量，因口感細(xì)膩、營養(yǎng)豐富深受消費(fèi)者的喜愛。金槍魚加工過程往往會(huì)產(chǎn)生占總重50~70％左右的下腳料，這些下腳料一般加工為飼料或魚餌，經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高，還會(huì)造成一定的環(huán)境污染。金槍魚皮含有豐富的膠原蛋白，三螺旋區(qū)域富含Pro和Hyp，是制備ACE抑制肽的良好來源。但膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，除金屬基質(zhì)蛋白酶外，其他蛋白酶很難接觸到膠原蛋白核心部位并釋放多肽，通常需要對(duì)原料進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理以松散

2、三螺旋結(jié)構(gòu)，暴露出內(nèi)部酶切位點(diǎn)，促進(jìn)三螺旋區(qū)活性肽段的釋放。傳統(tǒng)的預(yù)處理方式為酸、堿處理，但操作復(fù)雜且污染嚴(yán)重，超聲作為一種綠色能源可用于原料預(yù)處理。本文主要研究超聲預(yù)處理對(duì)金槍魚皮膠原ACE抑制肽釋放的影響機(jī)制，并對(duì)水解液胃腸消化特性以及其中高ACE抑制活性多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。
　　以金槍魚皮為原料，酶解液的DH和Hyp含量為指標(biāo)，對(duì)膠原蛋白三螺旋區(qū)肽段釋放的超聲預(yù)處理工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明超聲時(shí)間為20 min、超聲功率為

3、30%（195 W）、料液比為1：15時(shí)為最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件，該條件下酶解液DH為14.89%， Hyp含量為0.046 g。與未處理組相比，超聲處理組DH和Hyp含量有顯著提高（P＜0.05），表明超聲預(yù)處理促進(jìn)了酶解過程的進(jìn)行，同時(shí)促進(jìn)了膠原三螺旋區(qū)多肽的釋放。通過FTIR分析比較超聲預(yù)處理前后的金槍魚皮結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明超聲破壞了膠原蛋白構(gòu)象，從而促進(jìn)了膠原三螺旋區(qū)多肽的釋放，促進(jìn)了酶解過程的進(jìn)行。通過HPLC分析兩組酶解液中10 kDa

4、以下小分子多肽分布情況，結(jié)果表明超聲預(yù)處理組小分子含量為88.67%，未處理組為46.39%，說明超聲預(yù)處理組酶解液中含有大量來源于三螺旋區(qū)的小分子肽段。
　　為明確超聲預(yù)處理對(duì)金槍魚皮酶解過程ACE抑制肽釋放的影響，對(duì)不同預(yù)處理?xiàng)l件下酶解過程中酶解液的DH、ACE抑制率及分子量分布進(jìn)行測(cè)定，并通過DSC和FTIR分析超聲預(yù)處理前后金槍魚皮膠原蛋白熱穩(wěn)定性及膠原蛋白結(jié)構(gòu)變化。酶解過程酶解液DH、ACE抑制率測(cè)定結(jié)果表明，超聲預(yù)處理

5、對(duì)魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，可改變酶解模式，在酶解5min時(shí)，酶解液DH與未處理組有顯著差異（P＜0.05），且ACE抑制率均高于未處理組，說明超聲可促進(jìn)短時(shí)酶解過程中膠原三螺旋區(qū)ACE抑制肽的快速釋放。SDS-PAGE、HPLC分析組分分子量變化情況的結(jié)果表明，隨著酶解的進(jìn)行，10 kDa以上大分子組分含量呈往復(fù)增減的變化規(guī)律，超聲預(yù)處理可加速這一過程的進(jìn)行，從而提高ACE抑制肽的釋放效率。DSC結(jié)果表明，1~20 min的超

6、聲預(yù)處理可導(dǎo)致魚皮膠原熱變性溫度降低，與5 min酶解后，對(duì)應(yīng)酶解液具有高ACE抑制率的結(jié)果一致，說明1~20 min的超聲預(yù)處理一定程度上破壞了膠原構(gòu)象，可提高ACE抑制肽的釋放效率；但40 min的超聲預(yù)處理導(dǎo)致魚皮熱變性溫度升高，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的超聲處理促使大量組分溶出并快速被降解，未溶出的膠原主體穩(wěn)定性反而得到加強(qiáng)，造成熱穩(wěn)定性有所增加。FTIR結(jié)果表明，超聲預(yù)處理破壞了膠原蛋白內(nèi)部與N-H相關(guān)的氫鍵平衡，減少了維持三螺旋構(gòu)象

7、的分子間和分子內(nèi)締結(jié)氫鍵，減少蛋白結(jié)構(gòu)中與C=O相關(guān)的氫鍵作用，進(jìn)而松散了膠原三螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)造成膠原中α螺旋、β折疊含量減少，無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角含量增加，使膠原結(jié)構(gòu)向無序化轉(zhuǎn)變。這些變化可使更多的三螺旋區(qū)酶切位點(diǎn)暴露，在酶解過程中可以促進(jìn)ACE抑制肽的快速釋放。
　　為驗(yàn)證酶解液是否可在體內(nèi)發(fā)揮ACE抑制活性，通過體外模擬消化實(shí)驗(yàn)研究胃腸消化對(duì)酶解液ACE抑制活性的影響。結(jié)果表明各組消化液經(jīng)過腸胃模擬消化后ACE抑制活性均有所提

8、高，且其中含有大量分子量低于3 kDa的小分子多肽，易于被小腸上皮細(xì)胞吸收，并發(fā)揮其ACE抑制活性功效；其中超聲預(yù)處理20min和40 min組的5 min酶解液效果最為明顯，選取以上兩組酶解液對(duì)其中高ACE抑制活性多肽進(jìn)行進(jìn)一步分離鑒定。首先用E5U20的樣品對(duì)SephadexG-15分離樣品的條件進(jìn)行篩選，結(jié)果表明層析柱為1 m×10 mm，洗脫速度為0.5 mL/min，洗脫劑為蒸餾水的洗脫條件較好，兩組樣品均可分離為三個(gè)組分，其