VRK1及BANF1在食管癌發(fā)病和增殖過(guò)程中表達(dá)及其相關(guān)分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:
　　研究VRK1及其下游基因BANF1對(duì)鱗狀食管癌細(xì)胞的細(xì)胞周期及侵襲的影響，初步探討發(fā)病過(guò)程中可能存在的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.VRK1和BANF1在組織中的表達(dá)定位檢測(cè)
　　采用免疫組化方法檢測(cè)食管癌不同病理組織部位的VRK1和BANF1表達(dá)及其定位，初步分析其與食管癌的進(jìn)展是否相關(guān)。
　　2.不同食管癌分級(jí)的細(xì)胞中BANF1和VRK1表達(dá)的定量檢測(cè)
　　1)對(duì)不同食管癌分級(jí)的細(xì)胞

2、內(nèi)VRK1和BANF1進(jìn)行RNA提取，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(rt-PCR)，比較二者擴(kuò)增曲線和溶解曲線，確定二者在不同分級(jí)的食管癌細(xì)胞中的表達(dá)量高低。
　　3.初步研究VRK1和BANF1在食管癌細(xì)胞增殖過(guò)程的分子機(jī)制
　　1)干擾VRK1(siVRK1)最佳序列的確定以vrk-homo-176、vrk-homo-571，vrk-homo-862為試驗(yàn)靶基因合成干擾序列，以Western blot結(jié)果為依據(jù)篩

3、選最佳干擾序列(siRNA)。
　　2)Western blot檢測(cè)siVRK1后食管癌細(xì)胞系中VRK1的表達(dá)敲低效果以及BAF蛋白的表達(dá)水平，以驗(yàn)證BANF1作為VRK1的下游基因這一理論。
　　3)CCK-8及流式細(xì)胞術(shù)轉(zhuǎn)染、孵育后的細(xì)胞于OD450處檢測(cè)吸光度，其具體數(shù)值可反映細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的改變。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功后的食管癌細(xì)胞，可明確細(xì)胞周期受到影響的具體時(shí)期。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　

4、統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS21.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法包括:兩組獨(dú)立樣本之間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，多組計(jì)量資料之間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩組資料之間采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.VRK1和BANF1的表達(dá)與腫瘤分級(jí)之間的代表性免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，120例正常食管組織中VRK1和BANF1的陽(yáng)性率的分別為15.8％和13.3％。85例高分化的食管癌組織中陽(yáng)性率為75.3％和

5、71.8％。在35例低分化食管癌組織中，陽(yáng)性率為94.3％和91.4％。二者在在腫瘤分級(jí)上的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NVRK1=120,P=0.02;N BANF1=120,p=0.002)
　　2.腫瘤組織中VRK1和BANF1mRNA表達(dá)水平均高于鄰近正常組織，兩組間配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(N VRK1=120，P=0.044;N BANF1=120，p=0.040)。
　　3.Western blot試驗(yàn)

6、結(jié)果證明，siVRK571序列最有效，在兩株細(xì)胞中均有良好敲低效果，干擾VRK1后BANF1的表達(dá)明顯降低。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示siVRK后，細(xì)胞增殖能力減弱。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后，細(xì)胞周期較多的阻滯在S期后，S期上升，M分裂期下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.VRK1及BANF1在食管癌細(xì)胞中表達(dá)升高，其高表達(dá)在食管鱗狀細(xì)胞癌的病程進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用，并且與不良預(yù)后相關(guān)。
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