ATXN1在髓母細(xì)胞瘤和ALDH1在食管癌干性維持與侵襲中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、近年來，腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells，CSCs;也稱腫瘤起始細(xì)胞:tumorinitiatingcells，TICs)理論認(rèn)為腫瘤是一個(gè)異質(zhì)性的細(xì)胞群體，在這個(gè)細(xì)胞群體中存在一小部分具有自我更新、多向分化能力的細(xì)胞，并且這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲、成瘤和耐受放化療的能力。腫瘤干細(xì)胞理論的興起為我們深入認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并探尋新的治療靶點(diǎn)開辟了新的途徑。本研究主要包括以下兩部分內(nèi)容:
　　第一部分ATXN1對(duì)髓母細(xì)胞瘤

2、干性與侵襲特性的調(diào)控作用及其分子機(jī)制
　　髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)是兒童最常見的惡性腦腫瘤，臨床預(yù)后差。我們使用成球培養(yǎng)法從髓母細(xì)胞瘤中分離/富集了髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)其具有高侵襲性及高成瘤能力的特性。通過本課題組在肺癌和胃癌中對(duì)成球細(xì)胞與普通貼壁細(xì)胞的基因表達(dá)譜芯片分析，我們篩選出ATXN1這個(gè)差異性表達(dá)的基因并發(fā)現(xiàn)其在髓母細(xì)胞瘤成球細(xì)胞中高表達(dá)。通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)髓母細(xì)胞瘤中ATXN1的表達(dá)與其臨床預(yù)

3、后密切相關(guān)，因此進(jìn)一步研究了ATXN1在調(diào)控髓母細(xì)胞瘤自我更新及侵襲中的作用及可能的分子機(jī)制。本部分實(shí)驗(yàn)主要方法、研究結(jié)果及結(jié)論如下:
　　1、髓母細(xì)胞瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞系的建立。
　　為了更好的了解髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性并滿足實(shí)驗(yàn)研究的需要，我們收集了5例髓母細(xì)胞瘤原代標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng);并且成功建立了一株發(fā)生于成人的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。對(duì)建系后的細(xì)胞采用光鏡、電鏡、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、染色體分析和移植瘤等實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞

4、株生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。
　　2、使用成球培養(yǎng)法成功分離/富集髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，并進(jìn)行了生物學(xué)特性鑒定。
　　(1)用無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy、ons76和D283培養(yǎng)，三個(gè)細(xì)胞均能成球生長;(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球細(xì)胞(spherecells，SC)較單層培養(yǎng)細(xì)胞(monolayercell，MN)高表達(dá)干性相關(guān)基因Bmil、Nanog、Nestin、Oct4和Sox2及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2

5、、MMP7、MMP9和MMP13;(3)免疫熒光檢測(cè)表明Daoy-SC高表達(dá)Nestin、Sox2和CD133，低表達(dá)GFAP、MBP和βⅢ-tubulin;(4)Daoy-SC細(xì)胞于含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)則高表達(dá)GFAP、MBP和βⅢ-tubulin，不表達(dá)Nestin、Sox2和CD133;(5)Transwell實(shí)驗(yàn)表明Daoy-SC比Daoy-MN具有更強(qiáng)的侵襲能力;(6)裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)表明同數(shù)量級(jí)的Daoy-SC比Daoy

6、-MN細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤形成能力。上述結(jié)果從干性和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)、多向分化能力、侵襲和成瘤能力等幾個(gè)方面證實(shí)了成球生長的細(xì)胞具有TICs的特性。
　　3、通過基因芯片篩選出在胃癌和肺癌成球細(xì)胞中均高表達(dá)分子ATXN1，發(fā)現(xiàn)ATXN1在調(diào)控髓母細(xì)胞瘤的遷移、侵襲，自我更新及成瘤能力中均具有重要作用。
　　(1)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ATXN1在髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中高表達(dá);(2)利用慢病毒干擾Daoy和ons76細(xì)胞ATXN1

7、的表達(dá)后，可以顯著抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、克隆形成和成瘤能力;(3)過表達(dá)ATXN1則增強(qiáng)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞D283的侵襲和成瘤能力。
　　4、ATXN1在髓母細(xì)胞瘤手術(shù)切除標(biāo)本中的表達(dá)情況及其意義。
　　對(duì)262例髓母細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示ATXN1的表達(dá)與髓母細(xì)胞瘤的病理組織學(xué)分型和分子亞型相關(guān)。對(duì)124例有隨訪的髓母細(xì)胞瘤所做的生存曲線結(jié)果顯示ATXN1的表達(dá)與患者的生存時(shí)間成負(fù)相關(guān)(P=0.00

8、23)，表明ATXN1可以用作判斷髓母細(xì)胞瘤預(yù)后的指標(biāo)。
　　5、探討ATXN1在調(diào)控髓母細(xì)胞瘤侵襲和自我更新能力方面的可能分子機(jī)制。
　　(1)利用慢病毒干擾Daoy細(xì)胞ATXN1的表達(dá)后，可以顯著抑制髓母細(xì)胞瘤干性相關(guān)基因Nanog和侵襲相關(guān)基因MMP2的表達(dá)，同時(shí)Hedgehog信號(hào)通路的下游關(guān)鍵分子Gli1的表達(dá)也明顯下調(diào);(2)過表達(dá)D283細(xì)胞的ATXN1表達(dá)后，同樣可以增強(qiáng)其干性相關(guān)基因Nanog和侵襲相關(guān)基因

9、MMP2的表達(dá)，并且Gli1的表達(dá)也增強(qiáng);(3)用Hedgehog信號(hào)通路的激動(dòng)劑shh配體及抑制劑環(huán)耙明(KAAD-cyclopamin)作用同樣可以上調(diào)及下調(diào)ATXN1的表達(dá)，說明ATXN1的表達(dá)受Hedgehog信號(hào)通路影響;(4)利用siRNA干擾Gli1的表達(dá)后可降低Nanog和MMP2的表達(dá)，而ATXN1的表達(dá)卻沒不受影響，因而我們推測(cè)ATXN1做為Gli1的上游發(fā)揮作用，進(jìn)而影響Nanog和MMP2的表達(dá)。
　　第二

10、部分ALDH1在食管癌干性維持與侵襲中的作用及其分子機(jī)制研究
　　食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC，Esophagealsquamouscellcarcinoma)是常見的消化道惡性腫瘤。由于ESCC具有高侵襲及轉(zhuǎn)移的特性因而其預(yù)后不佳。而CSC假說則認(rèn)為腫瘤內(nèi)的TICs與其它細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是造成手術(shù)不易徹底切除和術(shù)后復(fù)發(fā)的根源。ESCC中TICs的標(biāo)志物尚不清楚，而乙醛脫氫酶1(ALDH1，Aldehydedehydr

11、ogenase1)是一個(gè)與多種腫瘤的TICs功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。我們推測(cè)ALDH1也可作為人ESCC中TICs的標(biāo)志物，因而檢測(cè)了ALDH1在ESCC中的表達(dá)及其意義。本部分實(shí)驗(yàn)主要方法、研究結(jié)果及結(jié)論如下:
　　1、ESCC中ALDH1high的細(xì)胞表現(xiàn)出TIC的特征。ALDH1high細(xì)胞高表達(dá)干性相關(guān)基因Sox2和Bmi1，并且ALDH1high比ALDH1low的細(xì)胞具有更強(qiáng)的成球能力、平板克隆形成能力和成瘤能力。
　

12、　2、ALDH1high的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。體外基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)及裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型都證實(shí)ALDH1high的細(xì)胞比ALDH1low的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。并且ALDH1high的細(xì)胞高表達(dá)MMP2、MMP7、MMP9和vimentin，低表達(dá)E-cadherin。表明ALDH1high細(xì)胞具有EMT表型相關(guān)的高侵襲和轉(zhuǎn)移特性。
　　3、ALDH1的表達(dá)與食管的不典型增生和惡性程度相關(guān)。ALDH1的表達(dá)與病