Gli2-miR-124-AURKA信號(hào)軸影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制.pdf

1、目的:
　　本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法整合神經(jīng)膠質(zhì)瘤拷貝數(shù)變化與基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出可能影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因(Gli2)，并以轉(zhuǎn)錄因子Gli2對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤下游靶基因的調(diào)控為重點(diǎn)，明確受轉(zhuǎn)錄因子Gli2調(diào)控的miRNAs，深入研究異?；罨腍h信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性增殖的分子機(jī)制，試圖發(fā)現(xiàn)新的分子靶標(biāo)，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤診療新靶點(diǎn)的選擇提供理論依據(jù)。
　　第一部分:整合分析神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因表達(dá)變化
　　方法:

2、
　　1、為了發(fā)掘可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，我們通過(guò)NCBIGEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索神經(jīng)膠質(zhì)瘤cGH芯片數(shù)據(jù)，通過(guò)CGH Analytics4.0軟件進(jìn)行深度分析，以期篩選出神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的拷貝數(shù)變化。
　　2、通過(guò)NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索神經(jīng)膠質(zhì)瘤表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集，進(jìn)行差異表達(dá)基因的meta分析，通過(guò)合并effect size以及p-value的基因芯片meta分析的方法明確不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中差異顯著的基因

3、，再將meta結(jié)果與拷貝數(shù)進(jìn)行交集，以期篩選可能影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的關(guān)鍵基因。
　　結(jié)果:
　　1、通過(guò)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤eGH芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析，我們發(fā)現(xiàn)包括107個(gè)基因在內(nèi)的14個(gè)染色體區(qū)域拷貝數(shù)發(fā)生改變。
　　2、通過(guò)基因芯片meta分析，我們發(fā)現(xiàn)312個(gè)在不同級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中差異表達(dá)的基因，將基因芯片meta分析的結(jié)合與拷貝數(shù)變化基因取交集后，我們篩選出11個(gè)關(guān)鍵基因(MYCN、JAK2、DMRT3、CDKN2

4、C、GLI2、KLF6、TXNL4A、C9ORF53、MET、BRFA、CALMK3)。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)整合拷貝數(shù)變化數(shù)據(jù)與基因表達(dá)譜改變，我們篩選出了11個(gè)可能參與影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的基因(MYCN、JAK2、DMRT3、CDKN2C、GLI2、KLF6、TXNL4A、C9ORF53、MET、BRFA、CALMK3)。
　　第二部分:轉(zhuǎn)錄因子Gli2功能探索
　　方法:
　　1、為了明確Gli2

5、對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，我們轉(zhuǎn)染sh-Gli2-228質(zhì)粒下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(H4、U87)Gli2水平，通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制Gli2表達(dá)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。為了進(jìn)一步探討Gli2對(duì)神經(jīng)質(zhì)瘤細(xì)胞活力的影響，我們?cè)诜謩e轉(zhuǎn)染shRNA control質(zhì)粒與shRNA-Gli2-228干擾質(zhì)粒后，同時(shí)給予Gli特異性抑制劑GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(H4、U87)48h，通過(guò)MTT

6、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力。
　　2、為了探討Gli2是否影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存，我們通過(guò)R2基因芯片分析平臺(tái)，分析Gli2對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者OS、PFS的影響。
　　結(jié)果:
　　1、通過(guò)平板克隆實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)干擾神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系Gli2表達(dá)后，細(xì)胞克隆形成能力顯著下降。通過(guò)MTT檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染shRNA control質(zhì)粒組，GANT61可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力，并呈一定的劑量依賴(lài)性，然而在轉(zhuǎn)染了sh-Gli2-

7、228質(zhì)粒干擾后，GANT61對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤活力抑制的劑量依賴(lài)性受到部分影響。
　　2、通過(guò)R2平臺(tái)進(jìn)行生存分析，在多個(gè)數(shù)據(jù)集中，我們發(fā)現(xiàn)，Gli2的高表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)，Gli2高表達(dá)的患者，PFS、OS時(shí)間更短。
　　結(jié)論:
　　1、Gli2影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。
　　2、Gli2高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良密切相關(guān)。
　　第三部分:轉(zhuǎn)錄因子Gli2調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-124表達(dá)
　　

8、方法:
　　1、為了研究Gli2是否參與調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞miRNA的表達(dá)，我們首先采用Gli特異性抑制劑GANT61(20μM，48h)阻斷H4細(xì)胞Hh信號(hào)通路，通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)miRNA表達(dá)變化，并通過(guò)Real-time PCR方法對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2、miRNA的表達(dá)受多種方式調(diào)控，為了探討Gli2是否在轉(zhuǎn)錄水平影響miR-124表達(dá)，我們采用RNAi技術(shù)干擾Gli2表達(dá)，通過(guò)Real-

9、time PCR檢測(cè)pri-miR-124、pre-miR-124與mature-miR-124的表達(dá)。
　　3、為了進(jìn)一步研究Gli2是否影響miR-124的轉(zhuǎn)錄，我們通過(guò)生物信息學(xué)在線分析預(yù)測(cè)在miR-124的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游區(qū)域是否存在潛在的Gli2結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Gli2是否與預(yù)測(cè)位點(diǎn)相結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　1、采用GANT61抑制Hh信號(hào)通路后，通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)34個(gè)m

10、iRNA的表達(dá)發(fā)生改變。通過(guò)Real-time PCR對(duì)芯片篩選出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-124，miR-302d，miR-519a，miR-335和miR-122表達(dá)變化情況與芯片結(jié)果一致。
　　2、采用RNAi技術(shù)干擾Gli2表達(dá)后，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞pre-miR-124，pri-miR-124，mature miR-124表達(dá)增加。
　　3、通過(guò)生物信息學(xué)在

11、線分析預(yù)測(cè)在miR-124的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游區(qū)域存在7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Gli2的潛在結(jié)合位點(diǎn)(BS1:-9789～-9798，BS2:-9255～-9234，BS3:-6235～-6244,BS4:-6034～-6025,BS5:-5547～-5538,BS6:-2944～-2935,and BS7:-560～-551)。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Gli2與miR-124的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列(BS2:-9255AGGCTGGTTTCAAACTCCTG

12、-9234)相結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　1、Gli2導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變。
　　2、Gli2通過(guò)與miR-124轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控miR-124表達(dá)。
　　第四部分:miR-124靶向調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞AURKA表達(dá)
　　方法:
　　1、我們通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-124的下游靶基因。
　　2、為了明確miR-124是否調(diào)控AURKA表達(dá)，我們分別上調(diào)

13、/下調(diào)miR-124表達(dá)，通過(guò)Real-time PCR和western blot檢測(cè)上調(diào)/下調(diào)miR-124對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞AURKA表達(dá)的影響。
　　3、為了進(jìn)一步明確miR-124是否通過(guò)與AURKA3'-UTR結(jié)合，直接靶向調(diào)控AURKA分子，我們通過(guò)luciferase實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-124對(duì)AURKA3'-UTR(wt)以及AURKA3'-UTR(mut)熒光素酶報(bào)告基因活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1、通

14、過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，AURKA是miR-124的潛在靶基因。
　　2、過(guò)表達(dá)miR-124后，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞AURKA mRNA與AURKA蛋白表達(dá)下降;反之，干擾miR-124表達(dá)后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞AURKA mRNA與AURKA蛋白表達(dá)增加。
　　3、Luciferase檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-124通過(guò)與AURKA3'-UTR區(qū)結(jié)合，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞AURKA表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、miR-124負(fù)性

15、調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞AURKA表達(dá)。
　　2、miR-124通過(guò)與AURKA mRNA3'-UTR結(jié)合而發(fā)揮抑制AURKA表達(dá)的功能。
　　第五部分:Gli2/miR-124/AURKA信號(hào)軸影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖
　　方法:
　　1、我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)GANT61阻斷Hh信號(hào)通路后，H4細(xì)胞基因表達(dá)譜發(fā)生改變，其中AURKA表達(dá)下降，然而對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析并未發(fā)現(xiàn)潛在的Gli2結(jié)合位點(diǎn)。我們?cè)诒卷?xiàng)目前一部

16、分的研究已經(jīng)證實(shí)Gli2調(diào)控miR-124表達(dá)，且miR-124靶向調(diào)控AURKA分子，為了探討Gli2是否通過(guò)miR-124影響AURKA表達(dá)，我們?cè)诮o予GANT61阻斷Hh信號(hào)通路的同時(shí)，干擾miR-124，通過(guò)western blot和Real-time PCR分別檢測(cè)AURKA蛋白和mRNA水平。
　　2、為了進(jìn)一步明確Gli2是否通過(guò)miR-124調(diào)控AURKA，我們?cè)谵D(zhuǎn)染Gli2干擾質(zhì)粒的同時(shí)下調(diào)miR-124水平，通

17、過(guò)western blot和Real-time PCR分別檢測(cè)AURKA蛋白和mRNA變化。
　　結(jié)果:
　　1、通過(guò)western blot與Real-time PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，采用GANT61抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Hh信號(hào)通路后，AURKA表達(dá)下降，而在抑制Hh信號(hào)的同時(shí)聯(lián)合干擾miR-124，AURKA表達(dá)有所增加。
　　2、通過(guò)western blot與Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載組相比，轉(zhuǎn)