趨化因子SDF-1和RANTES在外源性骨髓間充質(zhì)干細胞治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中的作用.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是最常見的關(guān)節(jié)疾病,以關(guān)節(jié)軟骨進行性的退變和最終的關(guān)節(jié)破壞為特征[1]。骨關(guān)節(jié)炎可造成患者疼痛和運動受限,給患者帶來極大的壓力。OA的病理機制尚不清楚,多種因素與OA的發(fā)生發(fā)展有關(guān):創(chuàng)傷、遺傳因素、關(guān)節(jié)位置異常、年齡、營養(yǎng)不良、生物力異常等。OA好發(fā)于膝關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)等負重關(guān)節(jié),其中顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular joint,TMJ)也是OA的好發(fā)部位之一。由于早期OA患者的標

2、本難以獲得,動物模型研究成為研究OA進展的有效手段。關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力有限,而自我再生的多為纖維軟骨,其力學性能較健康的透明軟骨差。目前尚缺少能有效逆轉(zhuǎn)或終止 OA進展的藥物,臨床治療策略仍以止痛、物理治療、控制炎癥反應(yīng)、減輕病人痛苦、減緩疾病進程等為主。干細胞治療是近些年備受關(guān)注的治療方法。有關(guān) OA軟骨的干細胞治療的臨床和動物實驗研究主要是應(yīng)用影像學、功能學、形態(tài)學等指標進行簡單的療效評價,尚未見有關(guān)于其療效的系統(tǒng)研究和其機理研

3、究的系統(tǒng)報道。進行干細胞治療的關(guān)鍵決定因素是干細胞能被受損組織趨化從而遷移至靶組織。靶組織中表達的趨化因子在干細胞的遷移中起了關(guān)鍵作用。趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)和RANTES是主要的介導(dǎo)干細胞遷移的分子,但關(guān)于SDF-1和RANTES在OA的干細胞治療中趨化作用的研究還未見報導(dǎo)。本研究在建立了致病作用確切的咬合源性的顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)全面

4、地論證了外源性骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)局部注射對顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用,并從干細胞存活、分化和趨化等方面探索其治療作用的機制,發(fā)現(xiàn)外源性BMSCs局部注射對咬合源性的TMJ OA有積極的治療效果,且該治療效果的關(guān)鍵機制是病變髁突高表達趨化因子SDF-1和RANTES,誘導(dǎo)外源性BMSCs遷移并定植于病變髁突中。整個研究分為以下三個部分:

5、r>　　第一部分:單側(cè)前牙反牙合致小鼠顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎及其機制的實驗研究
　　背景:顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(Temporomandibular joint disorders,TMD)被認為有多種致病因素,其中咬合因素備受關(guān)注。目前,關(guān)于咬合是TMD的致病因素還存在很大爭議。骨關(guān)節(jié)炎是 TMD的嚴重的病理變化形式,以軟骨退變和軟骨下骨異常改建為主要特征。最近,Semaphorin4D(Sema4D)和Plexin-B1被發(fā)現(xiàn)可抑制成骨

6、活動,但Sema4D/Plexin-B1在TMJ改建中的表達變化還未見報道。
　　目的:本研究的目的是建立一個原創(chuàng)性的改變小鼠咬合關(guān)系的動物模型,并觀察TMJ軟骨和軟骨下骨的組織學和相關(guān)因子的變化,以及Sema4D和Plexin-B1的表達變化。方法:在小鼠的左側(cè)下頜切牙或上下頜切牙粘接不良修復(fù)體,造成左側(cè)切牙的反牙合關(guān)系。用HE和甲苯胺藍染色方法觀察TMJ髁突的形態(tài)學改變。用組織化學和realtime-PCR手段檢測TRAP陽性

7、細胞和M-CSF表達水平,作為破骨活動的指標,成骨活動水平用骨鈣素(osteocalcin,OCN)的表達水平來觀察。用免疫組織化學和realtime-PCR檢測Sema4D和Plexin-B1的表達變化。用雙因素的方差分析來比較組間差異。
　　結(jié)果:粘接不良修復(fù)體1周和3周后,組織學上觀察到軟骨的退變和軟骨下骨丟失。破骨活動的指標(TRAP陽性細胞數(shù)和M-CSF表達水平)在軟骨和骨中均增高。OCN在軟骨中的表達在3周時升高,但在

8、軟骨下骨中在1周時升高,3周時降低。Sema4D在軟骨和軟骨下骨中的表達在1周時降低,在3周時升高,而Plexin-B1在軟骨下骨3周時升高。
　　結(jié)論:單側(cè)前牙反牙合的咬合關(guān)系可造成顳下頜關(guān)節(jié)髁突的異常改建,此過程涉及到軟骨退變、成骨和破骨活動的改變,以及Sema4D/Plexin-B1的參與。
　　第二部分:外源性骨髓間充質(zhì)干細胞對顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用
　　背景:干細胞治療是目前備受關(guān)注的治療骨關(guān)節(jié)炎的新方

9、法。骨髓間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能,是治療骨關(guān)節(jié)炎的理想種子細胞。盡管有臨床和動物研究報道干細胞對骨關(guān)節(jié)炎有治療效果,但目前尚沒有資料系統(tǒng)全面地評價骨髓間充質(zhì)干細胞局部注射對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用,及其相關(guān)分子的表達。
　　目的:本研究擬系統(tǒng)全面地論證外源性骨髓間充質(zhì)干細胞對顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。
　　方法:觀察拆除不良修復(fù)體后,顳下頜關(guān)節(jié)髁突的變化,以確定髁突病變的咬合源性。在造模3周時,開始每周在關(guān)節(jié)局部注射外源性

10、的GFP-BMSCs,用 HE和micro-CT的方法分析軟骨和軟骨下骨的形態(tài)學變化,用番紅 O染色觀察軟骨基質(zhì)的變化,用TRAP染色觀察軟骨下骨破骨活動的變化,用 GFP免疫組化染色觀察外源性GFP-BMSCs在髁突內(nèi)的定植情況,用GFP和Col-II、Col-I及OCN的免疫熒光雙標的方法觀察 GFP-BMSCs在髁突內(nèi)的分化情況,用 realtime-PCR檢測注射后髁突內(nèi)相關(guān)因子的表達。
　　結(jié)果:拆除不良修復(fù)體可部分逆轉(zhuǎn)

11、髁突的病變,說明髁突的病變是咬合源性的。關(guān)節(jié)局部注射 GFP-BMSCs可有效改善軟骨的厚度,逆轉(zhuǎn)軟骨下骨的丟失,且軟骨基質(zhì)得到了恢復(fù),破骨活動減少。注射的GFP-BMSCs可定植于病變髁突軟骨中,并表達Col-II,但不表達Col-I和OCN。軟骨內(nèi)的降低的Col-II、aggrecan、Col-X和升高的Col-I、OCN、MMP13、TNF-α和IL1β的表達被有效逆轉(zhuǎn),纖維化指標Col-III和Tenascin-C的表達下降。<

12、br>　　結(jié)論:關(guān)節(jié)腔局部注射外源性BMSCs對咬合源性的顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎有積極的治療作用,且該治療作用是基于BMSCs可定植于髁突軟骨,并向軟骨細胞分化。
　　第三部分:外源性骨髓間充質(zhì)干細胞治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的機制研究
　　背景:干細胞在組織局部的存活、分化、遷移和定植是進行干細胞治療的基礎(chǔ),也是進行干細胞治療的前提,但BMSCs對骨關(guān)節(jié)炎治療作用的機制還不甚明了。
　　目的:本研究擬從干細胞存活、分化、定植

13、和趨化等方面探索外源性BMSCs治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的機制。
　　方法:應(yīng)用Transwell體外共培養(yǎng)的方法觀察病變髁突對BMSCs的誘導(dǎo)分化和定植作用;應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)觀察BMSCs在體內(nèi)的存活狀態(tài);用免疫組化和realtime-PCR檢測病變髁突中SDF-1和CXCR4的表達水平,應(yīng)用體外阻斷CXCR4和CCR1信號通路的方法檢測趨化信號SDF-1/CXCR4和RANTES/CCR1在病變髁突誘導(dǎo)BMSCs遷移中的作用,并

14、用體內(nèi)阻斷CXCR4和CCR1的方法檢測SDF-1/CXCR4和RANTES/CCR1在BMSCs治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中的關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果:Transwell共培養(yǎng)結(jié)果顯示病變和正常髁突均可誘導(dǎo)BMSCs陽性表達Col-II,但病變髁突可誘導(dǎo)BMSCs定植于髁突軟骨中。生物發(fā)光結(jié)果顯示BMSCs在顳下頜關(guān)節(jié)局部的存活能力高峰在注射后第7天,且實驗組的發(fā)光強度低于對照組,而軟骨細胞的存活能力在實驗組和對照組均較低。病變髁突高表