基于3株相互配對單克隆抗體的膠乳增強免疫比濁檢測高爾基體蛋白73方法的建立及其應用研究.pdf

1、目的:肝細胞癌（HCC）是目前世界范圍內(nèi)致死率位居第五的惡性腫瘤，也是近年來發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一。HCC的進展快、預后差、惡性程度高，并且臨床上診斷為肝癌的患者已多屬于中、晚期，使之缺乏有效的治療手段，術(shù)后復發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，預后效果差，因此肝癌患者的早診斷、早治療尤為重要。目前，甲胎蛋白(AFP)是診斷HCC最重要、最常規(guī)的血清學標志物，但其敏感性(39-64％)和特異性(76-91％)不高，使部分的早期肝癌患者無法得到及時地診斷

2、和治療，無法滿足臨床肝癌診斷的要求。因此，尋找一種更為理想的肝癌診斷血清學標志物顯得非常重要。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)高爾基體蛋白73(GP73)在診斷肝癌中的敏感性和特異性均高于AFP，因此，GP73可能成為肝癌早期診斷更為理想的血清學標志物。為了評估其臨床應用價值，建立了膠乳增強免疫比濁法(LTIA)用于血清中GP73的定量檢測。對膠乳粒子進行了表征，建立了基于多克隆抗體和3株可以兩兩配對單克隆抗體的LTIA，并對其臨床應用進行初步評估。

3、
　　方法:
　　(1)膠乳粒子表征。采用透射電鏡(TEM)檢測了其粒徑大小和形態(tài);采用動態(tài)光散射(DLS)檢測了其水合粒徑和Zeta電位;采用納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(NTA)檢測了其水合粒徑和納米粒子的濃度;并且采用傅里葉變換紅外分析(FTIR)和電導滴定法測定了其羧基含量。
　　(2)基于多克隆抗體的膠乳增強免疫比濁分析。以GP73多克隆抗體包被膠乳粒子，對膠乳粒子的粒徑、1-[3-二甲氨基丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽

4、酸鹽(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)濃度、多抗的濃度、活化膠乳粒子的體積和聚乙二醇6000(PEG-6000)濃度等實驗條件進行優(yōu)化，以GP73重組蛋白為標準品建立標準曲線，對實驗的精密度、最低檢出限、干擾進行分析，并用此方法測定80例健康人和80例肝癌患者血清中GP73含量，進行受試者工作特征曲線(ROC)曲線分析。
　　(3)基于3株單克隆抗體的膠乳增強免疫比濁分析。以3株GP73的單克隆抗體包被膠乳粒子，對EDC/N

5、HS濃度、3株單抗的濃度、活化膠乳粒子的體積和PEG-6000濃度等實驗條件進行優(yōu)化，以GP73重組蛋白為標準品建立標準曲線，對實驗的精密度、最低檢出限、干擾進行分析，并用此方法測定80例健康人和80例肝癌患者血清中GP73含量，進行ROC曲線分析。
　　結(jié)果:
　　(1)86nm和107nm膠乳粒子表面光滑、分散性好;水合粒徑和濃度分析結(jié)果相差不大;Zeta電位值分別為-39.2和-41.9 mV，其絕對值均大于30 mV

6、，說明這兩種膠乳粒子均比較穩(wěn)定;FTIR顯示粒子表面有羧基基團;電位滴定法分析其羧基含量均為0.6 mmol/g。
　　(2)成功建立了基于多克隆的LTIA，該方法的線性范圍為20-320 ng/mL，精密度分析得到批內(nèi)變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）＜8％，批間CV＜10％，最低檢出限為2.11 ng/mL，滿足其對臨床樣本的檢測要求，抗干擾能力強，ROC曲線分析得到其敏感性為94.6％，特異性

7、為72.4％。
　　(3)進一步建立了基于3株單克隆抗體的LTIA，線性范圍為10-350 ng/mL，精密度分析得到批內(nèi)CV＜8％，批間CV＜10％，最低檢出限為1.82 ng/mL，滿足其對臨床樣本的檢測要求，抗干擾能力強，ROC曲線分析得到其敏感性為96.7％，特異性為93.3％。
　　結(jié)論:本實驗成功建立了基于多克隆抗體和3株單克隆抗體的LTIA，為臨床檢測GP73提供了新的方法，并且發(fā)現(xiàn)應用基于3株兩兩配對單克隆抗