Gabra-3基因A至IRNA編輯位點(diǎn)的鑒定及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、由腺苷酸脫氨基酶(ADAR)介導(dǎo)的A（腺嘌呤核苷酸）至I（次黃嘌呤核苷酸）的RNA編輯作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后加工方式越來(lái)越受到人們的關(guān)注。ADAR通過(guò)自身的雙鏈結(jié)合域識(shí)別并結(jié)合pre-mRNA形成的雙鏈區(qū)，催化特定A脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)镮，進(jìn)而使遺傳信息在RNA水平發(fā)生改變。對(duì)于蛋白編碼基因，RNA編輯可能最終引起蛋白質(zhì)功能的改變、增加生物體中蛋白質(zhì)的多樣性以及表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。A至I的RNA編輯大量發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的離子通道基因，γ-

2、氨基丁酸受體就是其中之一。研究表明，ADAR1和ADAR2共同作用于小鼠GABAA基因α3亞基(Gabra-3)外顯子9自身形成的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其中一個(gè)A位點(diǎn)脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)镮，密碼子的改變使原先編碼的異亮氨酸(I)轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?M)，該編輯過(guò)程對(duì)小鼠GABAA受體的生物學(xué)功能有非常重要的作用。
　　 對(duì)Gabra-3基因A至IRNA編輯的研究表明：人、小鼠、狗等哺乳動(dòng)物以及雞的I/M位點(diǎn)都受到編輯，而兩棲綱的蛙和魚綱的河豚魚

3、中此位點(diǎn)為組成型的G（鳥嘌呤核苷酸）。本研究為了進(jìn)一步確定該位點(diǎn)RNA編輯發(fā)生的進(jìn)化位置，對(duì)進(jìn)化關(guān)系介于雞和蛙之間的爬行綱物種蜥蜴、平嘴鱷魚、中華烏龜，兩棲綱物種東方蠑螈、墨西哥鈍口螈Gabra-3基因的RNA編輯位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，三種爬行綱動(dòng)物的腦組織中Gabra-3基因的I/M位點(diǎn)都發(fā)生了編輯，而兩棲綱的東方蠑螈、墨西哥鈍口螈在該位點(diǎn)無(wú)編輯跡象?；谝陨辖Y(jié)果我們推斷：在進(jìn)化史上該位點(diǎn)G較早出現(xiàn)，當(dāng)兩棲類分化出蛙形目和有尾目后

4、，該位點(diǎn)受特定選擇壓力的影響發(fā)生了G至A的突變，但隨后的爬行綱中產(chǎn)生的A至I RNA編輯在一定程度上消除了G至A突變對(duì)該基因的影響，從而維持了基因編碼產(chǎn)物的保守性。此外，本研究還對(duì)哺乳綱、鳥綱、爬行綱各物種該位點(diǎn)的編輯效率進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，在哺乳綱到兩棲綱約4.5億年的進(jìn)化歷程中，該位點(diǎn)的編輯效率具有從高到低直至0的變化趨勢(shì)。
　　 Gabra-3基因外顯子9自身形成的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)編碼16個(gè)氨基酸，是目前發(fā)現(xiàn)最小的受A

5、至I RNA編輯影響的天然莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是研究RNA編輯調(diào)控機(jī)制的理想模型。本研究的另一部分內(nèi)容是構(gòu)建無(wú)義突變的Gabra-3迷你基因，運(yùn)用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄生成RNA分子。這些RNA分子可以形成與自然界能夠發(fā)生編輯的Gabra-3相似的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)。利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，我們對(duì)突變后的迷你基因I/M位點(diǎn)的編輯情況進(jìn)行了體內(nèi)檢測(cè)。結(jié)果表明I/M位點(diǎn)周圍的序列以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)都對(duì)編輯效率有顯著影響。我們用RNA化學(xué)藥劑結(jié)構(gòu)分析法

6、對(duì)人野生型Gabra-3迷你基因、以及突變體GC/UC、GC/CU、GC/CC的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明這四個(gè)RNA分子真實(shí)的二級(jí)結(jié)構(gòu)支持先前預(yù)測(cè)的最佳結(jié)構(gòu)，這反映了我們基于預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)提出結(jié)論的可靠性。但我們就受編輯與非編輯莖環(huán)之間的結(jié)構(gòu)差異無(wú)法總結(jié)出規(guī)律用以推斷I/M位點(diǎn)的編輯與否，鑒于此我們推測(cè)：盡管RNA分子的一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)都將影響ADARs的識(shí)別，但RNA序列在體內(nèi)真實(shí)的三級(jí)構(gòu)象信息可能最終決定著與ADARs是否互作。

7、>　　 此外，我們還設(shè)計(jì)了溫度控制實(shí)驗(yàn)，通過(guò)改變RNA折疊溫度調(diào)節(jié)最終形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控I/M位點(diǎn)的編輯。當(dāng)溫度升高到37℃時(shí)，原本不能被ADARs識(shí)別的GC/UC、GC/CC突變迷你基因莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了編輯。同時(shí)，我們也證實(shí)了GC/UC、GC/CC突變迷你基因在37℃時(shí)形成的結(jié)構(gòu)的確與25℃形成的不同。
　　 我們將編輯前、后的小鼠Gabra-3全長(zhǎng)基因與小鼠Gabraβ、Gabaraγ共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，使用全細(xì)