文昌魚(yú)天然兔疫探索-體液的調(diào)理作用以及溶菌酶基因克隆.pdf

1、補(bǔ)體系統(tǒng)是先天性免疫系統(tǒng)的重要成分，脊椎動(dòng)物尤其是哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)作用機(jī)制己經(jīng)比較清晰，而無(wú)脊椎動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)僅在頭索動(dòng)物文昌魚(yú)、尾索動(dòng)物海鞘、棘皮動(dòng)物等少數(shù)物種中開(kāi)展。文昌魚(yú)屬于頭索動(dòng)物，在進(jìn)化地位上屬于無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的過(guò)渡型，故對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)的發(fā)育和進(jìn)化的研究有著很重要的意義。己有研究表明文昌魚(yú)存在補(bǔ)體系統(tǒng)，己經(jīng)克隆得到的補(bǔ)體成分包括C3，Bf，MASP以及C6-like等。在功能上文昌魚(yú)體液能夠通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)的替代途徑，發(fā)

2、揮溶解紅血球和病原菌的作用。但文昌魚(yú)補(bǔ)體功能上是否如脊椎動(dòng)物補(bǔ)體一樣，具有調(diào)理作用尚不清楚。
　　本文的主要目的即是探究文昌魚(yú)補(bǔ)體系統(tǒng)是否具有調(diào)理吞噬作用。文昌魚(yú)具有與脊椎動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)大體相似的循環(huán)系統(tǒng)，但是沒(méi)有可以自由循環(huán)的血細(xì)胞。所以，本實(shí)驗(yàn)選用了妒魚(yú)(Lateolabrax japonicus)巨噬細(xì)胞研究文昌魚(yú)體液的調(diào)理作用，也就是把與文昌魚(yú)體液作用過(guò)的酵母細(xì)胞和妒魚(yú)巨噬細(xì)胞混合，共育后統(tǒng)計(jì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，由此來(lái)評(píng)價(jià)文

3、昌魚(yú)體液的調(diào)理作用。首先，酵母經(jīng)文昌魚(yú)體液孵育后與妒魚(yú)巨噬細(xì)胞混合進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)，妒魚(yú)的巨噬細(xì)胞的吞噬能力顯著提高。這說(shuō)明文昌魚(yú)體液與妒魚(yú)巨噬細(xì)胞之間存在相互作用，也說(shuō)明文昌魚(yú)體液具有調(diào)理吞噬的作用。文昌魚(yú)體液的調(diào)理作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性；文昌魚(yú)體液梯度稀釋4倍后，仍然能夠顯著促進(jìn)妒魚(yú)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。將文昌魚(yú)體液加熱45oC處理30min后（夠?qū)⒀a(bǔ)體失活）再處理酵母，進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)文昌魚(yú)體液的調(diào)理作用明顯減弱。這暗示文昌魚(yú)體液的

4、這種調(diào)理作用可能與補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)。C3是脊椎動(dòng)物中補(bǔ)體系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)理作用的主要成分，為了驗(yàn)證文昌魚(yú)補(bǔ)體系統(tǒng)中C3是否參與文昌魚(yú)補(bǔ)體調(diào)理作用，利用抗原抗體反應(yīng)將文昌魚(yú)體液中的C3成分沉淀后，進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明用C3抗體處理過(guò)的體液，其調(diào)理吞噬作用明顯減弱。同樣，用Bf（替代途徑激活的重要因子）抗體處理文昌魚(yú)體液后進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)，文昌魚(yú)體液的調(diào)理作用也明顯減弱。這些都說(shuō)明文昌魚(yú)體液的調(diào)理吞噬作用的確與補(bǔ)體有關(guān)。另外，用文昌魚(yú)體液處理酵母后，

5、從酵母表面洗脫下來(lái)的蛋白片段經(jīng)電泳和Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)能夠與C3抗體結(jié)合，說(shuō)明C3的裂解片段能夠結(jié)合到酵母表面，這為文昌魚(yú)體液的調(diào)理吞噬作用是通過(guò)補(bǔ)體來(lái)實(shí)現(xiàn)提供了進(jìn)一步證據(jù)。綜上所述，文昌魚(yú)體液可能是通過(guò)替代途徑將補(bǔ)體激活，導(dǎo)致C3的裂解片段沉積到酵母表面，通過(guò)巨噬細(xì)胞上相應(yīng)的受體的識(shí)別發(fā)揮調(diào)理吞噬作用。
　　本研究證明文昌魚(yú)補(bǔ)體系統(tǒng)可以和脊椎動(dòng)物（妒魚(yú)）巨噬細(xì)胞互作，符合并支持無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物補(bǔ)體共同起源假設(shè)

6、。溶菌酶是先天性免疫的重要成分，在動(dòng)物界中存在三種類型：g型溶菌酶，c型溶菌酶和i型溶菌酶。文昌魚(yú)是目前唯一兼具三種類型溶菌酶的物種，對(duì)研究溶菌酶的發(fā)生和進(jìn)化有極其重要的意義。從文昌魚(yú)中克隆了全長(zhǎng)為1014bp的g型溶菌酶(AmpLyz-g)，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?01 bp，編碼266個(gè)氨基酸。該蛋白序列經(jīng)Signal P3.0server預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其氨基端有15個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。經(jīng)Smart預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)域，文昌魚(yú)AmpLyz-g含有g(shù)型

7、溶菌酶共有的結(jié)構(gòu)域STL（如圖3-11）及三個(gè)可能的的催化位點(diǎn)（E153，E187以及D178）。AmpLyz-g與魚(yú)類的g型溶菌酶蛋白序列的一致性很高，可達(dá)到50％以上，與哺乳動(dòng)物一致性則相對(duì)較低，僅30％左右。文昌魚(yú)的g型溶菌酶蛋白序列由七個(gè)外顯子編碼，前三個(gè)外顯子不包含任何結(jié)構(gòu)域，后四個(gè)外顯子與脊椎動(dòng)物的四個(gè)外顯子一一對(duì)應(yīng)，且內(nèi)含子插入類型也完全一致。從文昌魚(yú)中克隆到了兩個(gè)i型溶菌酶(AmpLyz-i) cDNA全長(zhǎng)，較長(zhǎng)i型溶菌

8、酶的為全長(zhǎng)1053 bp的，較短的cDNA全長(zhǎng)849 bp，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?01bp，編碼167個(gè)氨基酸，且這兩個(gè)序列開(kāi)放閱讀框序列一致。該蛋白包括一個(gè)i型溶菌酶的保守結(jié)構(gòu)域destabilase及三個(gè)保守的催化位點(diǎn)（Glu36，Asp49以及Asn120）。AmpLyz-i與同為后口動(dòng)物的棘皮動(dòng)物i型溶菌酶序列的一致性很高，可達(dá)到60％左右。文昌魚(yú)Lyz-i與節(jié)肢動(dòng)物一致性比較低，不到30％。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，三類溶菌酶各自聚為一簇，