應(yīng)激反應(yīng)基因NDRG2在AD神經(jīng)病理損傷中的保護(hù)作用與機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。它是老年期癡呆最常見的一種類型[1]，以不斷進(jìn)展的記憶障礙、全面智能減退、個(gè)性改變以及精神行為異常為主要臨床表現(xiàn)，是全球老年人的主要致殘、致死疾病之一。隨著全球人口老齡化加劇，世界各地的 AD發(fā)病率逐年上升，根據(jù)國際阿爾茨海默病協(xié)會(huì)（Alzheimer's DiseaseInternational，ADI）2016年公布的數(shù)據(jù)，目前全球約有4

2、680萬AD患者，平均每3秒即新發(fā)1例；根據(jù)預(yù)測(cè)，全球阿爾茨海默病患者例數(shù)到2030年將達(dá)到7470萬例，2050年將突破1億，高達(dá)1億3150萬例[2]。2010年，ADI報(bào)告每年全球用于治療和護(hù)理AD患者的費(fèi)用超過6040億美元[3]。目前我國AD患者估計(jì)在800萬到1000萬，報(bào)告指出，未來中國和世界均面臨治療和照顧數(shù)量龐大的AD患者的重負(fù)[4]。AD典型的病理特征是腦神經(jīng)細(xì)胞外出現(xiàn)由β淀粉樣蛋白（amyloidβ protein

3、，Aβ）聚集形成的老年斑[5]，腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元原發(fā)變性、壞死[6,7]。由于目前AD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，治療主要依靠口服藥物治療包括改善膽堿能神經(jīng)傳遞的藥物和抗氧化藥物等進(jìn)行對(duì)癥治療[8]。因藥物在病灶部位聚集量有限，故尚無理想的根治效果。因此深入探討AD發(fā)病的分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)調(diào)控AD病程的關(guān)鍵分子，對(duì)AD的基礎(chǔ)研究和臨床診治意義重大。
　　人源的 NDRG2基因是第四軍醫(yī)大學(xué)生

4、化教研室于1999年發(fā)現(xiàn)并克隆[9]。NDRG2基因定位于染色體14q11.2，含有16個(gè)外顯子，15個(gè)內(nèi)含子，編碼含有371個(gè)氨基酸殘基、分子量約41kDa的蛋白[9]。Mitchelmore等發(fā)現(xiàn)NDRG2在AD患者腦組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組受試者[10]，但NDRG2表達(dá)增高究竟是參與促進(jìn)AD的發(fā)展，還是在Aβ等應(yīng)激反應(yīng)條件下細(xì)胞啟動(dòng)的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制并不清楚。作為一個(gè)新的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)基因，NDRG2參與多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，并且

5、主要表達(dá)于小鼠腦組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞[11,12]。而星形膠質(zhì)細(xì)胞本身又參與多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，表明NDRG2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的生理和病理反應(yīng)過程中起到了不可或缺的作用[13]。
　　綜上，本實(shí)驗(yàn)旨在探究NDRG2在AD病理發(fā)展過程中的作用，為AD的預(yù)防和治療提供更多科學(xué)依據(jù)，為藥物干預(yù)和基礎(chǔ)研究進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一：在AD病理進(jìn)程中NDRG2的表達(dá)水平變化規(guī)律
　　目的：觀察在 AD病理進(jìn)程中不同月齡的同

6、窩 APP/PS1小鼠的海馬區(qū) NDRG2表達(dá)變化。
　　方法：設(shè)置4組同窩APP/PS1雄性小鼠，每組3只，分別定于4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材：2月齡、5月齡、8月齡、11月齡。在相應(yīng)取材時(shí)間將小鼠處死取腦，統(tǒng)一取左半腦做冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)NDRG2和GFAP的水平表達(dá)情況；取右半腦海馬組織使用Western Blot技術(shù)檢測(cè)NDRG2、GFAP和β淀粉樣蛋白表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：免疫熒光結(jié)果顯示，隨著月齡增加，四組小

7、鼠海馬區(qū) NDRG2和 GFAP表達(dá)增高；與免疫熒光染色結(jié)果相對(duì)應(yīng)，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著月齡增加，11月齡組小鼠海馬區(qū)GFAP表達(dá)水平顯著高于其他三組（P＜0.05）；四組小鼠海馬區(qū)Aβ1-42蛋白水平隨著鼠齡增加而顯著遞增（P＜0.05）；海馬區(qū)NDRG2表達(dá)也隨著鼠齡增加而顯著遞增（P＜0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)二：NDRG2-/-小鼠注射AβO造模后學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)
　　目的：分別將NDRG2敲除小鼠

8、和正常小鼠在側(cè)腦室注射Aβ寡聚體造模后進(jìn)行記憶能力檢測(cè)并對(duì)比結(jié)果，觀察NDRG2在AD病理進(jìn)程中所起的作用。
　　方法：首先將Aβ單體進(jìn)行老化處理得到Aβ寡聚體(AβO)。2月齡的C57背景的雄性小鼠設(shè)置成4組，每組8只，分別對(duì)每只小鼠進(jìn)行雙側(cè)側(cè)腦室注射。第一組是野生型 C57小鼠雙側(cè)側(cè)腦室各注射5ulAβ寡聚體;第二組是 NDRG2基因敲除（Ndrg2-/-）小鼠雙側(cè)側(cè)腦室各注射5ul Aβ寡聚體；第三組是野生C57小鼠雙側(cè)側(cè)腦

9、室各注射5ul生理鹽水；第四組是Ndrg2-/-小鼠雙側(cè)側(cè)腦室各注射5ul生理鹽水。注射完后將小鼠放回動(dòng)物房飼養(yǎng)2周，然后進(jìn)行三天的新事物識(shí)別的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完畢后處死小鼠取材，用Western Blot檢測(cè)四組小鼠海馬勻漿的NDRG2和β淀粉樣蛋白表達(dá)水平進(jìn)行造模驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.側(cè)腦室注射生理鹽水組的NDRG2敲除小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)總距離、平均速度和穿格次數(shù)顯著高于其他三組小鼠（P＜0.01）。

10、r>　　2.四組小鼠首次對(duì)相同物塊的探索時(shí)間比率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；間隔1小時(shí)后對(duì)不同物塊的探索時(shí)間比率，側(cè)腦室注射生理鹽水的兩組小鼠對(duì)新物塊探索時(shí)間顯著高于側(cè)腦室注射Aβ寡聚體的兩組小鼠（P＜0.05）；間隔24小時(shí)后，對(duì)不同物塊的探索時(shí)間比率上 NDRG2敲除的側(cè)腦室注射 Aβ寡聚體組的小鼠顯著低于其他三組（P＜0.01），且其他三組在新物塊探索時(shí)間比率上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　實(shí)驗(yàn)三：利用NDRG2-/-APP/PS1雙基因修飾小鼠

11、進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)
　　目的：通過交配繁殖得到NDRG2敲除的AD模型小鼠，進(jìn)一步驗(yàn)證NDRG2在AD病理進(jìn)程中的作用。
　　方法：用 NDRG2敲除小鼠和 APP/PS1小鼠進(jìn)行交配得到 NDRG2雜合的APP/PS1子一代小鼠，然后將得到的基因型為（NDRG2+/-APP/PS1）的小鼠與NDRG2敲除小鼠回交，得到NDRG2敲除的AD小鼠模型NDRG2-/-APP/PS1。
　　然后將小鼠設(shè)置成兩組，第一組是NDRG

12、2敲除的APP/PS1雄性小鼠8月齡（n=4），第二組是普通APP/PS1雄性小鼠8月齡（n=4）。將兩組小鼠進(jìn)行3天的新事物識(shí)別的檢測(cè)并將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
　　結(jié)果：
　　1.NDRG2-/-APP/PS1小鼠組在曠場(chǎng)試驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)總距離、運(yùn)動(dòng)平均速度和穿格次數(shù)較APP/PS1組顯著增高（P＜0.01）。
　　2.兩組小鼠對(duì)相同物塊的探索時(shí)間比率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；間隔1小時(shí)后對(duì)不同物塊的探索時(shí)間比率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；間隔24

13、小時(shí)后對(duì)不同物塊的探索時(shí)間比率， NDRG2敲除的APP/PS1組小鼠顯著低于NDRG2未敲除的APP/PS1組小鼠（P＜0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)四：NDRG2基因缺失對(duì)AD小鼠腦中蛋白酶體功能亞基表達(dá)水平的影響
　　目的：觀察NDRG2對(duì)AD小鼠海馬區(qū)蛋白酶體亞基表達(dá)水平的影響。
　　方法：分別提取8月齡APP/PS1小鼠和NDRG2敲除的APP/PS1小鼠的海馬組織RNA，運(yùn)用RT-PCR的方法，檢測(cè)蛋白酶體亞基PS

14、MB5、PSMB6及PSMB7的mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　與普通APP/PS1小鼠比較，NDRG2敲除的APP/PS1小鼠海馬組織的PSMB6的mRNA水平顯著降低(P＜0.05)，而PSMB5和PSMB7無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.在AD病理進(jìn)程中，小鼠海馬區(qū)的NDRG2和Aβ蛋白的表達(dá)隨時(shí)間增加而增高。
　　2.敲除NDRG2基因的小鼠側(cè)腦室注射Aβ寡聚體進(jìn)行AD造模后，動(dòng)物長期記憶受到損傷

15、而短期記憶沒有明顯變化。
　　3.在經(jīng)過交配繁殖得到的 NDRG2-/-APP/PS1基因型小鼠，在8月齡與普通APP/PS1小鼠相比較，長期記憶受到損傷而短期記憶沒有顯著差異。
　　4.NDRG2的缺失降低了AD小鼠海馬區(qū)蛋白酶體亞基PSMB6 mRNA的含量。小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Western Blot、免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)方法，表明AD病理進(jìn)程中海馬區(qū)NDRG2和β淀粉樣蛋白的表達(dá)變化，然后運(yùn)用側(cè)腦室注射β淀粉樣蛋白寡聚體構(gòu)