細(xì)胞表面APP介導(dǎo)AD相關(guān)神經(jīng)病理改變的機(jī)制研究.pdf

1、Alzheimer’s病(AD)的特征性病理變化是p淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)形成的細(xì)胞外的老年斑(senileplaque，SP)，異常磷酸化Tau蛋白形成的神經(jīng)元內(nèi)纖維纏結(jié)(NETs)，神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)障礙，以及神經(jīng)元缺失，神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)受損等。目前己知β淀粉樣蛋白前體蛋白(β-amyloidprecursorprotein，APP)參與AD病理改變的形成，但其機(jī)制尚未得到解析。本實(shí)驗(yàn)利用特異性識(shí)別APP氨基端的

2、APP-N抗體對(duì)細(xì)胞表面APP作用以模擬配體一受體的結(jié)合，在整體動(dòng)物和原代培養(yǎng)神經(jīng)元水平，研究細(xì)胞表面APP介導(dǎo)的效應(yīng)，只要涉及β淀粉樣蛋白的生成，Tau的磷酸化的變化以及神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)障礙，并進(jìn)一步對(duì)其中的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。主要研究結(jié)果如下： 1.SD大鼠額葉皮層注射APP-N抗體48小時(shí)后，用抗APP-N抗體的二抗直接標(biāo)記，免疫熒光結(jié)果顯示注射部位額葉皮層內(nèi)有密集點(diǎn)狀分布的免疫陽(yáng)性物質(zhì)，這些點(diǎn)狀分布物質(zhì)同時(shí)可被識(shí)別APP羧基端

3、的抗體所標(biāo)記。提示APP-N抗體可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞表面APP的作用，介導(dǎo)APP在細(xì)胞表面局部聚集和重新分布。 2.免疫熒光法觀察到不管在動(dòng)物腦皮層還是原代培養(yǎng)神經(jīng)元，經(jīng)APP-N抗體處理后，均有Aβ染色明顯增強(qiáng)，Aβ染色強(qiáng)陽(yáng)性部位同時(shí)有APP染色增強(qiáng)。為分析這些部位是否有Aβ生成相關(guān)途徑的激活，實(shí)驗(yàn)觀察了與酶切形成Aβ有關(guān)的γ-分泌酶組成成份早老蛋白-1，結(jié)果顯示APP-N抗體在誘導(dǎo)APP局部聚集的同時(shí)也可募集早老蛋白-1。這種募集

4、早老蛋白-1的效應(yīng)可能與局部APP降解生成Aβ增加有關(guān)。 3.SD大鼠額葉皮層注射APP-N抗體后，CV染色法和Bielschowsky銀染法觀察到注射部位神經(jīng)元固縮，以及神經(jīng)突起的變性；原代培養(yǎng)神經(jīng)元在APP-N抗體作用后，MTT顯示細(xì)胞活性下降。另外，用免疫組化和免疫印跡顯示，在APP-N抗體作用后有AD神經(jīng)纖維纏節(jié)相關(guān)的Tau蛋白磷酸化增加。這些結(jié)果提示經(jīng)APP-N抗體作用，細(xì)胞表面APP可介導(dǎo)神經(jīng)元損傷。 4.實(shí)

5、驗(yàn)觀察到APP-N抗體作用后，在腦皮層和原代培養(yǎng)神經(jīng)元中均出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)障礙表現(xiàn)，如神經(jīng)纖維排列紊亂，神經(jīng)突起腫脹或斷裂，神經(jīng)突起急性成角，成環(huán)等。由于這些神經(jīng)突起有不僅有APP的強(qiáng)陽(yáng)性染色，同時(shí)也有整合素(Integrin)染色增加，提示這些神經(jīng)突起的營(yíng)養(yǎng)障礙改變可能與Integerin相關(guān)的局部黏附(focaladhesion，F(xiàn)A)機(jī)制的異常激活有關(guān)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用熒光三標(biāo)技術(shù)，在培養(yǎng)的神經(jīng)元上證實(shí)APP-N在誘導(dǎo)APP局部聚集的同時(shí)有

6、整合素和肌動(dòng)蛋白(actin)參與的局部黏附斑樣結(jié)構(gòu)的異常增加。 5．實(shí)驗(yàn)采用鈣離子熒光探針Flu3，探討APP-N抗體作用于神經(jīng)元細(xì)胞表面APP對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響。熒光檢測(cè)顯示，APP-N抗體作用可導(dǎo)致部分神經(jīng)元胞內(nèi)游離鈣的濃度和分布的改變，少數(shù)神經(jīng)元可瞬間發(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加。 總之，離體和在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞表面APP在APP-N抗體的作用下，可通過(guò)APP局部聚集并募集早老蛋白1使Aβ生成增加，同時(shí)也可導(dǎo)致Tau蛋