螢火蟲熒光素酶及釀酒酵母ATP硫酸化酶在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及其應(yīng)用.pdf

1、熒光素酶是由一條多肽鏈組成的高效生物催化劑。在ATP、Mg2+、O2等適宜的條件下，能夠以熒光素為底物發(fā)生催化反應(yīng)并發(fā)出熒光。本文將北美螢火蟲熒光素酶基因克隆到大腸桿菌中，用隨機(jī)突變的方法未篩選到對酸堿或溫度耐受性增強(qiáng)的熒光素酶突變體。分析酶的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其第232位的疏水性異亮氨酸的周圍負(fù)電荷氨基酸太多，將異亮氨酸定點(diǎn)突變成帶正電的賴氨酸后，連到表達(dá)載體pET30a(+)上，導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21(DE3)中，獲得高效表達(dá)螢火蟲熒光素酶的

2、重組菌Q2/pET30a-luc、Q3/pET30a-luc-I232K，經(jīng)鎳柱純化出目的蛋白后，測得突變體Luc(I232K)比活力(4.68×1012 RLU/mg)較Luc比活力(1.94×1012 RLU/mg)高2.41倍。
　　 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)底物ATP及熒光素對兩種熒光素酶的反應(yīng)動力學(xué)曲線均是s型的。Mg2+及CoA可以提高兩種酶的活性，CoA還可延長發(fā)光時間，其最適濃度分別為10mM、20μM。本文還探究了幾種不同的

3、酶保存液對兩種熒光素酶的影響。2.0 mMEDTA、1.0 mM DTT、30μg/mL BSA是保護(hù)這兩種酶最適宜的條件。Luc在(NH4)2SO4或TritonX-100分別為1 mM、0.1％時存活率最高，而突變體Luc(I232K)對(NH4)2SO4或TritonX-100耐受性更高，最適宜的濃度分別為2mM、0.15％。但這兩種保護(hù)劑的濃度繼續(xù)升高時會使兩種酶的活性下降。突變體Luc(I232K)較Luc在pH5時活性更高，

4、活性pH范圍更廣。其最適反應(yīng)溫度范圍(22℃～28℃)較Luc(22℃～25℃)更寬。Luc(I232K)長時間存放于-20℃、4℃、22℃時，其酶存活率比Luc高。40℃保溫5 min后，Luc(I232K)、Luc酶存活率分別為77％、8.6％，放置1h后，Luc完全失活，Luc(I232K)酶存活率10％。
　　 將以上純化的突變體Luc(I232K)應(yīng)用于微生物細(xì)胞ATP含量的測定中，使用季銨鹽類表面活性劑苯扎氯銨(BA

5、C)提取細(xì)胞內(nèi)ATP，其濃度在低于0.03％時，對熒光素酶活性干擾小，苯扎氯銨提取不同菌的ATP的最適濃度和時間為:霍亂弧菌0.02％、2 min，大腸桿菌0.03％、3 min，惡臭假單胞菌0.02％、3 min，枯草芽孢桿菌0.01％、2 min。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ATP濃度與發(fā)光強(qiáng)度相關(guān)性良好，同時細(xì)菌數(shù)目與生物發(fā)光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)也有良好的相關(guān)性，通過測定發(fā)光值推算出霍亂弧菌ATP含量約為0.24～0.45×10-18 mol/個，大腸

6、桿菌ATP含量約為0.65～1.27×10-17 mol/個，惡臭假單胞菌ATP含量約為0.14～0.2×1016 mol/個，枯草芽孢桿菌ATP含量約為0.08～0.25×10-16mol/個，實(shí)驗(yàn)測得每種細(xì)菌的不同生長階段ATP含量基本一樣。將突變體Luc(I232K)應(yīng)用到納米材料ZnO對惡臭假單胞菌細(xì)胞活性的影響中，結(jié)果是納米材料ZnO雖促進(jìn)其生物膜形成，但對其細(xì)胞活性無影響，也可能是儀器檢測ATP的下限不夠低、ATP提取劑苯扎

7、氯銨對熒光素酶Luc(I232K)活性有少許抑制作用及本實(shí)驗(yàn)方法不能用于檢測細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的極其微量的變化。
　　 將螢火蟲熒光素酶與ATP硫酸化酶偶聯(lián)可以應(yīng)用于PPi測定、DNA聚合酶活性測定等方面。通過將釀酒酵母ATP硫酸化酶基因met3連到表達(dá)載體pET30a(+)上，導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21(DE3)中，獲得了高效表達(dá)ATP硫酸化酶的重組菌Q4/pET30a-met3。將經(jīng)鎳親和層析純化后的ATP硫酸化酶與熒光素酶Luc(