摻硼B(yǎng)G-PCL復(fù)合材料對大鼠BMSCs成骨及成血管作用的研究.pdf

1、目的：
　　本研究使用高溫熔融方法制備化學(xué)組成為6Na2O-8K2O-8MgO-22CaO-18B2O3-36SiO2-2P2O5(mol％)的摻硼生物活性玻璃(B-BG，Boron dopped Bioactive Glass)粉體，并將其與聚己內(nèi)酯(PCL，Polycaprolactone)復(fù)合制成B-BG含量分別為10、20、30、40wt.%的B-BG/PCL復(fù)合材料，通過B-BG與PCL的復(fù)合，研究材料的機械性能、降解性

2、能、體外成骨和成血管性能。并且，通過研究上述復(fù)合材料對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs，Bone Mesenchymal Stem Cells)的成骨及成血管作用，篩選出綜合性能良好的B-BG/PCL復(fù)合生物材料。
　　材料和方法：
　　1. B-BG/PCL復(fù)合材料的制備：采用高溫熔融方法制備化學(xué)組成為6Na2O-8K2O-8MgO-22CaO-18B2O3-36SiO2-2P2O5(mol%)的B-BG粉體，將其與PCL

3、材料結(jié)合制成不同 B-BG含量分別為0、10wt.%、20wt.%、30wt.%和40wt.%的B-BG/PCL復(fù)合膜。
　　2.材料性能檢測：1）分組：實驗組分別為10wt.%B-BG/PCL、20wt.%B-BG/PCL、30wt.%B-BG/PCL、40wt.%B-BG/PCL，以純PCL為對照組；2）拉伸強度測試；3）體外降解pH值檢測：材料浸入Tris-HCl溶液中檢測pH值變化；4）體外降解速率檢測。
　　3.大

4、鼠BMSCs的分離培養(yǎng)和成骨分化能力檢測：1）采用貼壁培養(yǎng)法對大鼠BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)；2）光鏡觀察大鼠BMSCs的形態(tài)；3）ALP染色：成骨誘導(dǎo)7天后行ALP染色；4）茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)21、28天后行茜素紅染色。
　　4. B-BG/PCL復(fù)合材料對大鼠 BMSCs作用的體外實驗：1）分組：實驗組分別為10wt.%B-BG/PCL、20wt.%B-BG/PCL、30wt.%B-BG/PCL、40wt.%B-BG/PCL，以

5、純PCL為對照組；2）MTT實驗：MTT實驗檢測細(xì)胞培養(yǎng)于材料表面1、4、7天后的增殖活性；3）RT-PCR：細(xì)胞培養(yǎng)4、7、10天后提取RNA，RT-PCR檢測成骨標(biāo)志基因核心蛋白結(jié)合因子2（runt-related transcription factor2，Runx2）、骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）、1型膠原（collagen type1，COL1）、骨涎蛋白（bone si

6、aloprotein，BSP）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）以及成血管標(biāo)志基因血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素-1（angiogenin-1，ANG-1）的相對表達(dá)量；4）ALP染色和ALP定量檢測：細(xì)胞培養(yǎng)10天后行ALP染色；培養(yǎng)4、7、10天時行ALP定量檢測。
　　結(jié)果：
　　1.材料

7、性能檢測
　　1）拉伸強度測試：實驗組各組材料拉伸強度比對照組均有明顯提高(P＜0.05)。其中10wt.%B-BG組的材料拉伸強度比其他所有組都高(P＜0.05)。20wt.%B-BG組、30wt.%B-BG組、40wt.%B-BG組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　2）體外降解pH值檢測：前6天pH值呈下降趨勢，之后相對趨于平穩(wěn)。實驗組pH值下降幅度小于對照組。對照組浸泡12天后pH值已降至6.15，而各實驗組浸泡1

8、2天后pH值范圍為6.4-6.82。不同實驗組間對比，B-BG含量越高，pH值越接近于人體中性值。
　　3）體外降解速率檢測：實驗組B-BG含量越高，降解越快，降解2-3周后失重率數(shù)值接近B-BG含量數(shù)值，對照組降解較慢。降解5周后，20wt.%B-BG組和30wt.%B-BG組的失重率分別達(dá)到了16.4%和25.8%，比較符合骨修復(fù)材料的理想降解速率。
　　2.大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)和成骨分化能力檢測
　　1）大鼠

9、BMSCs的形態(tài)：傳代后3天的P1代細(xì)胞即可達(dá)到70％-80％的細(xì)胞密度，細(xì)胞呈長梭形，成簇貼壁生長，細(xì)胞生長旺盛。
　　2）大鼠BMSCs的ALP染色：成骨誘導(dǎo)后ALP染色較深。
　　3）大鼠BMSCs的茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)后茜素紅鈣結(jié)節(jié)明顯。
　　3. B-BG/PCL復(fù)合材料對大鼠BMSCs作用的體外實驗
　　1） MTT實驗：各組細(xì)胞增殖活性隨時間上升，其中，30wt.%B-BG組明顯高于其他組(P＜0.

10、05)。但培養(yǎng)7天時40wt.%B-BG組增殖活性與對照組相比明顯下降(P＜0．05)。
　　2）RT-PCR檢測：細(xì)胞培養(yǎng)4、7、10天后所有實驗組的Runx2、OPN和VEGF表達(dá)都顯著高于對照組（P<0.05）。其中30wt.%B-BG組在Runx2、BMP-2、BSP、OPN、VEGF和ANG-1的表達(dá)方面顯著高于其他所有組(P＜0.05)。在COL1、BSP、OCN和ANG-1的表達(dá)方面，10wt.%B-BG組與純PCL

11、組沒有明顯差異（P＞0.05）。培養(yǎng)4天時，10wt.%B-BG組的BMP-2表達(dá)也與純PCL組沒有明顯差異（P＞0.05）。3）ALP染色和ALP定量檢測：ALP染色30wt.%B-BG組著色最明顯。細(xì)胞培養(yǎng)4、7、10天后30wt.%B-BG組的ALP定量活性最高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　將B-BG與PCL復(fù)合制成的新型材料相比純PCL具有更合適的機械性能和降解性能。與純PCL相比，適量B-BG的復(fù)合能顯著促進(jìn)