缺氧預處理對顱腦外傷大鼠內質網應激蛋白P-eIF2α、GADD34表達影響的實驗研究.pdf

1、課題背景：
　　戰(zhàn)爭即有傷亡，顱腦外傷（Traumatic Brain Injury，TBI）是士兵眾多戰(zhàn)傷類型中的主要損傷形式之一，甚者是致死的重要原因，具有表現形式多樣、病情發(fā)展迅速、死亡率高、預后差異性大等眾多特點?，F已逐漸成為各大軍事及地方醫(yī)學院、研究所等機構研究的重要領域。隨著科學技術水平的不斷發(fā)展和進步，交通工具尤其是汽車的使用率逐漸增加，使得TBI的發(fā)生率逐年上升。因無法干預顱腦外傷相關直接作用力的情況下，尋找能最大

2、程度降低外傷后腦組織繼發(fā)性損害的方法，如炎性應激、氧化應激及內質網應激等，為臨床中提高顱腦外傷患者的救治率、降低死亡率以及最大程度降低傷殘率等方面，都有著重要的意義。缺氧預處理（Hypoxic preconditioning，HPC）是指通過提前給予一定程度適當的低氧訓練，可以顯著的增強機體各組織，尤其是腦組織對于隨后突發(fā)的各種缺血、缺氧等打擊的耐受能力，提高自身的防護，從而發(fā)揮重要的神經保護，抗缺血、缺氧等造成的應激損傷能力。磷酸化的

3、真核翻譯起始因子2α(Phosphorylated eukaryotic translation initiation factor2 alpha，P-eIF2α)在內質網應激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）時由eIF2α發(fā)生磷酸化產生，磷酸化后導致內質網中蛋白質合成受到阻礙。當ERS持續(xù)發(fā)生時，P-eIF2α持續(xù)生成，導致正常功能的蛋白質合成嚴重受阻，然而可以選擇性的合成細胞凋亡基因，最終導致細胞走

4、向凋亡或壞死。生長停滯與DNA損害可誘導蛋白34（Growth arrest and DNA damage-inducible protein34，GADD34）是內質網應激過程中的重要分子，參與內質網中蛋白質合成受阻后的再啟動。研究缺氧預處理對顱腦外傷中內質網應激及其相關凋亡的變化規(guī)律，可促進改善顱腦外傷后神經元損傷、凋亡及行為認知功能，為臨床工作中提高對TBI的救治提供有利的基礎理論支持。
　　第一部分缺氧預處理對顱腦外傷大鼠

5、皮層內質網應激蛋白P-eIF2α表達及神經元凋亡影響的實驗研究
　　目的：
　?。?）觀察顱腦外傷后大鼠腦組織病理改變及缺氧預處理對其改變的影響；
　?。?）探討缺氧預處理對顱腦外傷大鼠皮層腦組織內質網應激蛋白P-eIF2α表達變化及神經元凋亡的影響。
　　方法：
　　208只成年雄性SD大鼠采用隨機數字表法分為以下4個實驗組：對照（Con）組、缺氧預處理（HPC）組、外傷（TBI）組、缺氧預處理顱腦外傷（

6、HPCT）組。TBI組與HPCT組進一步分為：1h、3h、6h、12h和24h、3d、7d、14d時間點共8個亞組。Con組僅進行頭皮切開及縫合處理，隨后處死。采用改良的Feeney’s法自由落體腦損傷打擊方法制作顱腦外傷大鼠動物模型。打擊點定位于：前囟門后3.0mm，且中線左側旁開3.0mm處，骨窗直徑約5.0mm；打擊重量及高度：50g砝碼，垂直高度為25cm處自由落下撞擊骨窗，打擊深度約3-4mm。缺氧預處理模型是在顱腦外傷打擊前

7、在低壓氧倉內預先給予適當的缺氧訓練（-50.47 KPa，3h/d，連續(xù)3d）。采用HE染色法和制作新鮮腦組織標本超薄切片，分別在光鏡和電鏡下觀察各組大鼠腦組織大體結構和神經元細胞超微結構改變；免疫組化法和Western Blotting法檢測挫傷部位周圍皮層腦組織中P-eIF2α蛋白的表達變化，以及TUNEL染色法檢測神經元凋亡變化情況。
　　結果：
　?。?）Con組和HPC組光鏡和電鏡下觀察發(fā)現腦組織大體及微觀結構無明

8、顯改變， HPCT組較TBI組大鼠腦組織光鏡下改變明顯減輕，電鏡下神經元細胞超微結構受損減輕，完整性保持較好，內質網結構受損減輕。
　?。?）免疫組化染色及Western Botting法檢測發(fā)現，P-eIF2α蛋白在顱腦外傷后3h表達開始增加，傷后6h-12h時間段表達呈上升趨勢，在傷后24h達到高峰，隨后在3d-14d逐漸下降；其中，傷后6h-7d時間段P-eIF2α蛋白表達HPCT組較TBI組顯著下降，兩組比較差異具有統(tǒng)計學

9、意義(P＜0.05)。TUNEL染色觀察神經元凋亡情況發(fā)現，傷后6h TBI組和HPCT組凋亡細胞逐漸開始表達，傷后12h-24h凋亡細胞數逐漸增加，傷后3d達高峰，隨后在傷后7d-14d逐漸恢復。其中，HPCT組較TBI組在傷后12h-7d時間凋亡細胞數明顯下降，凋亡率顯著降低，兩組比較差異具有顯著性意義（P＜0.05）。
　　結論：
　?。?）缺氧預處理可顯著降低大鼠顱腦外傷后腦組織病理改變，較好的維持神經元細胞超微結構

10、的完整性，減輕內質網損傷。
　?。?）缺氧預處理可通過選擇性抑制顱腦外傷大鼠皮層內質網應激蛋白P-eIF2α的表達，減輕ERS引起的損傷，降低神經元細胞凋亡，繼而促進細胞存活并維持神經元功能的穩(wěn)定。
　　第二部分缺氧預處理對顱腦外傷大鼠海馬GADD34表達及行為學影響的實驗研究
　　目的：
　　探討缺氧預處理對顱腦外傷大鼠海馬GADD34表達及行為學變化的影響，研究缺氧預處理參與減低顱腦外傷后內質網應激損傷的機制

11、。
　　方法：
　　清潔新西蘭SD雄性大鼠共48只，使用隨機數字表法分為對照（Con）組，缺氧預處理（HPC）組，顱腦外傷（TBI）組，缺氧預處理顱腦外傷（HPCT）組。大鼠顱腦外傷模型采用改良的自由落體裝置制作，預先將大鼠在低壓氧倉(-50.47 kPa)內訓練3小時/天、連續(xù)3天來制作缺氧預處理動物模型。四組大鼠均在傷后24h處死并留取相應標本。采用改良Sugrwara法對大鼠傷后24h行為學進行評估；采用RT-PCR、

12、蛋白免疫印跡（Western Blotting）法以及免疫組化染色檢測顱腦外傷大鼠海馬組織中GADD34 mRNA和蛋白的表達變化，以及TUNEL染色觀察神經元凋亡變化情況。
　　結果：
　　RT-PCR、蛋白免疫印跡和免疫組化染色發(fā)現，HPCT組大鼠海馬組織中GADD34 mRNA及蛋白表達較TBI組顯著增高,兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而且，外傷后24h行為學評分HPCT組大鼠明顯高于TBI組，兩組進行比