miR-200s調(diào)控 CAFs細(xì)胞活化及活性維持并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、第一章 miR-200及其靶基因TCF12和Fli-1通過調(diào)節(jié)乳腺癌CAFs細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移
　　目的：探索miR-200s使CAF活化，調(diào)控ECM蛋白的異常沉積，并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法：（1）原代分離獲得乳腺癌病人來源的正常成纖維細(xì)胞（NF:Normal fibroblast）和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（ CAF：Cancer-associated fibroblast）。（2）

2、qRT-PCR檢測這20對NF和CAF細(xì)胞中miR-200s的表達(dá)。（3）利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，將乳腺癌細(xì)胞與NF細(xì)胞共培養(yǎng)，qRT-PCR檢測miR-200s的表達(dá)。（4）qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定miR-200s的靶基因。(5)利用shRNA和基因過表達(dá)技術(shù)，驗(yàn)證miR-200s及其靶基因促進(jìn)CAF的活化。（6）利用膠收縮、qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-200s

3、及其靶基因?qū)CM重塑的影響（7）癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤模型驗(yàn)證miR-200s及其靶基因促對乳癌轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：（1）原代培養(yǎng)獲得20對成對的乳腺癌病人來源的NF和CAF細(xì)胞。（2）qRT-PCR結(jié)果顯示miR-200s在CAF中下調(diào)的真實(shí)性和普遍性。（3） qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)癌細(xì)胞共培養(yǎng)激活的 NF細(xì)胞中miR-200s表達(dá)下調(diào)。（4）qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明TCF12和Fl

4、i-1分別是miR-141和miR-200b的靶基因。(5)利用shRNA和基因過表達(dá)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-200s的NFs具有活化的CAFs的特征，CAF活化標(biāo)志物?-SMA、FAP表達(dá)增加，其遷移侵襲能力增強(qiáng)；CAFs中恢復(fù)miR-200s的表達(dá)，部分抑制CAF功能并出現(xiàn)NF表型特征。（6）利用膠收縮、qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-200s及其靶基因通過調(diào)控下游一系列ECM成分相關(guān)基因，尤其是FN和LOX

5、的表達(dá)，促進(jìn)ECM重塑。（7）體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)和臨床病例研究更進(jìn)一步證實(shí)miR-200s及其靶基因?qū)AF活化、ECM重塑、乳癌轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)論：（1）下調(diào)的miR-200s導(dǎo)致細(xì)胞分化相關(guān)的靶轉(zhuǎn)錄因子Fli-1和TCF12異常表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌CAFs活化。（2）miR-200s及其靶基因Fli-1和TCF12介導(dǎo)了乳癌微環(huán)境ECM重塑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。揭示CAFs促進(jìn)乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的新的分子機(jī)制，為靶向腫瘤微環(huán)境的治療

6、提供新靶點(diǎn)。
　　第二章離體CAFs活化的自我維持
　　目的：探索miR-200s維持CAF的活化狀態(tài)及機(jī)制。
　　方法：（1）5’-aza處理CAF細(xì)胞，qRT-PCR檢測miR-200s的表達(dá)。（2）Western Blot檢測成對NF和CAF細(xì)胞中甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)差異。（3）利用基因干擾技術(shù)，沉默CAF細(xì)胞中Dnmt3b的表達(dá)，qRT-PCR檢測miR-200s的表達(dá)。（4）qRT-PCR、Western Bl

7、ot和雙熒光素酶驗(yàn)證miR-200b/200c的靶基因Dnmt3b。（5）TGF-β1處理CAF后，qRT-PCR檢測miR-200s的表達(dá)，Western Blot檢測Dnmt3b及miR-200s的靶基因TCF12和Fli-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）5’-aza處理CAF細(xì)胞，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-200s表達(dá)增加。（2）Western Blot結(jié)果顯示CAF細(xì)胞中Dnmt3b表達(dá)明顯高于NFs。（3）qRT-PCR結(jié)果

8、顯示沉默CAF細(xì)胞中Dnmt3b的表達(dá)，miR-200s表達(dá)增加。（4）qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶結(jié)果顯示Dnmt3b是miR-200b/200c的靶基因。（5）qRT-PCR發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理CAF細(xì)胞，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-200s下調(diào)，撤離外源性TGF-β1并正常培養(yǎng)CAF細(xì)胞，miR-200s持續(xù)低表達(dá)；而Western Blot結(jié)果顯示Dnmt3b表達(dá)增加，同時(shí)靶基因TCF12和Fli-1的