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文檔簡介
1、目的:神經(jīng)炎癥與小膠質(zhì)細胞激活在帕金森病發(fā)病機制中起著非常重要的作用,可能引起多巴胺能神經(jīng)元的損傷和死亡。去甲茴三硫(ADT-OH)是一種能夠釋放H2S的物質(zhì),H2S是一種重要的氣體信號因子來調(diào)節(jié)腦內(nèi)穩(wěn)態(tài),有證據(jù)顯示H2S能夠抑制促炎性細胞因子的表達。本研究目的在于探究去甲茴三硫是否具有較好的抑制神經(jīng)炎癥及抗腫瘤效應(yīng),從而能夠?qū)ε两鹕〉闹委熖峁┮欢ǖ慕梃b意義。
方法:體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞系BV2及多巴胺能神經(jīng)元SH-SY5Y細
2、胞系,利用LPS的刺激來建立小膠質(zhì)細胞持續(xù)過度激活模型,對細胞模型進行加藥預處理,根據(jù)藥物處理的濃度梯度和時間梯度實驗結(jié)果確定最佳處理時間和有效濃度。采用Weston-blot檢測下游炎癥因子iNOS、COX2蛋白含量的改變,運用ELISA檢測細胞分泌到上清中的促炎性因子IL-6、TNF-α含量的變化。運用RT-PCR及Q-PCR檢測一系列炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的變化。此外利用 Weston-blot及免疫熒光染色觀察加藥處理的細胞模型中 N
3、F-κB通路蛋白的磷酸化水平及核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。利用小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基處理SH-SY5Y,通過MTT法,PI染色,流式等來觀察去甲茴三硫是否能夠間接性的保護多巴胺能神經(jīng)元。利用MTT法檢測去甲茴三硫是否能夠抑制多種腫瘤細胞系的活性及增殖,利用流式細胞儀檢測腫瘤細胞系細胞周期的變化。
結(jié)果:對小膠質(zhì)細胞過度激活模型加藥處理實驗結(jié)果表明 ADT-OH能夠明顯的抑制LPS引起的BV2激活,并且ADT-OH本身對小膠質(zhì)細胞狀態(tài)沒有明顯的影
4、響。ADT-OH的預處理能夠明顯抑制促炎性因子(如iNOS,COX2,IL-6,TNF-α等)的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的增加。Weston-bolt檢測NF-κB通路的IKK及其磷酸化活性和IκB家族蛋白水平,p65及其磷酸化水平的變化,發(fā)現(xiàn)LPS刺激30 min內(nèi),ADT-OH的處理能夠使IKK的磷酸化水平明顯下調(diào),同時p65的磷酸化也同樣被抑制。通過免疫熒光觀察到LPS刺激30 min內(nèi)ADT-OH的預處理能夠明顯抑制LPS引起的p65核轉(zhuǎn)
5、位現(xiàn)象。制備不同處理條件的小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基,培養(yǎng)SH-SY5Y細胞48 h,PI/Hochest染色結(jié)果與MTT測試結(jié)果均表明ADT-OH能夠通過抑制膠質(zhì)細胞過度激活引起的神經(jīng)炎癥來間接的對多巴胺能神經(jīng)元起到保護作用。不同濃度的 ADT-OH處理 HeLa,A549等幾種腫瘤細胞系24 h或48 h,MTT細胞活性測試結(jié)果顯示ADT-OH能夠明顯地抑制腫瘤細胞的活性,同時流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞發(fā)生細胞周期阻滯現(xiàn)象。
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