蛋白質(zhì)組學(xué)微量樣本的制備與質(zhì)譜分析技術(shù).pdf

1、本論文針對基礎(chǔ)與臨床蛋白質(zhì)組研究中，微量蛋白質(zhì)組樣本的制備與質(zhì)譜分析的需求，開展了兩個方面的研究工作:
　　(1)石蠟包埋組織的蛋白質(zhì)提取與規(guī)?；b定方法學(xué)研究;
　　(2)小鼠肝臟細胞類型的分離純化。
　　通過福爾馬林固定和石蠟包埋，臨床病理組織能夠獲得很好的保存。這些樣本具備完善的病理信息及臨床跟蹤信息，是極好的疾病蛋白質(zhì)組研究與疾病標志物發(fā)現(xiàn)研究對象。為了深入挖掘這些樣本所蘊含的生物學(xué)與臨床價值，一種有效的策略，

2、是針對石蠟包埋組織開展規(guī)?；牡鞍踪|(zhì)組分析，利用定量研究策略，發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白質(zhì)及候選分子標志物。
　　在第一部分的實驗內(nèi)容中，我們建立了包埋組織蛋白質(zhì)的提取方法。同時，針對回收的微量蛋白質(zhì)，比較了采用普通膠內(nèi)酶切和原位凝膠膠內(nèi)酶切兩種方法，開展蛋白質(zhì)的規(guī)?；b定。結(jié)果顯示，福爾馬林固定石蠟包埋的鼠肝組織樣本經(jīng)回收后，可以獲得與新鮮鼠肝樣本表達譜相近的鑒定效果，說明固定和包埋過程對于組織樣本的表達譜鑒定沒有影響，常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)分

3、析流程，可以兼容石蠟包埋的鼠肝組織。
　　微量蛋白質(zhì)組樣本處理過程中，需要考慮在去除溶液中的污染小分子的同時、盡量避免樣本損失，聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)提供了一個很好的介質(zhì)。本研究比較了將微量樣本，先進行短區(qū)間SDS-PAGE分離，以及直接將蛋白質(zhì)固化到PAGE凝膠兩種方法。利用短區(qū)間的SDS-PAGE，在一個90min的質(zhì)譜梯度中，我們實現(xiàn)了從10μg的Hela全細胞裂解液中鑒定到2931個蛋白。在相同的實驗條件下，我們從10

4、μg新鮮凍存鼠肝樣本和等量的石蠟包埋鼠肝組織樣本中分別鑒定到2301和2264個蛋白，上述結(jié)果一方面說明，石蠟包埋組織內(nèi)的蛋白質(zhì)可以有效提取，同時，SDS-PAGE膠內(nèi)酶切技術(shù)可以穩(wěn)定地應(yīng)用于微量樣本蛋白質(zhì)組分析中。
　　我們比較了用原位凝膠(in-situ PAGE)膠內(nèi)酶切的方法，來處理上述樣本。該方法的特點是，蛋白質(zhì)混合物在PAGE膠凝固的同時，固化到膠中，后續(xù)的小分子污染物清洗和蛋白質(zhì)酶解，完全等同于SDS-PAGE分離后

5、的樣本。因此，in-situ方法，較普通的膠內(nèi)酶切要簡單。基于該方法，分別從10μg的人Hela細胞裂解液、新鮮凍存鼠肝樣本、石蠟包埋鼠肝樣本最高鑒定到2327、2164和2077個蛋白，略低于用膠內(nèi)酶切達到的鑒定量。但是，in-situ PAGE方法處理后，蛋白質(zhì)的鑒定量十分穩(wěn)定，說明in-situ PAGE方法可能更適用于非標記定量的蛋白質(zhì)組分析應(yīng)用。
　　針對石蠟包埋組織的分析發(fā)現(xiàn)，福爾馬林固定并沒有對酶切產(chǎn)生不良影響。同時

6、，從總離子流色譜圖的肽段洗脫順序中，我們發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定及石蠟包埋的特殊處理過程，并不會影響肽段混合物的整體親疏水性分布。這些結(jié)果說明石蠟包埋組織塊，完整地儲存了臨床樣本中的蛋白質(zhì)組信息，具備開展規(guī)?；治黾昂蜻x生物標志物發(fā)現(xiàn)的潛力。
　　在第二部分的實驗內(nèi)容中，我們意圖將小鼠肝臟實現(xiàn)細胞分類，獲得微量的肝臟細胞進行實驗，也為后期的分泌蛋白質(zhì)組及肝臟細胞類型蛋白質(zhì)組研究奠定基礎(chǔ)。我們改進Seglen的膠原法，獲得肝臟原位循環(huán)灌流的