促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)對干眼性別特異性及對眼表炎癥消退調(diào)控的研究.pdf

1、目的：
　　干眼是臨床中較為常見的炎癥性和自發(fā)性免疫眼表疾病。由于干眼致病因素及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，臨床中尚無針對病因的有效治療藥物。近年來促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)的抗炎和促進(jìn)炎癥消散的作用已得到廣泛認(rèn)同，并開始應(yīng)用于臨床中炎性疾病的治療，但其對于干眼的治療效果至今尚無充分的動物實(shí)驗(yàn)證據(jù)及相關(guān)機(jī)制探討。因此，本實(shí)驗(yàn)在首先建立淚液蒸發(fā)過強(qiáng)合并分泌不足型干眼鼠模型的基礎(chǔ)上，研究干眼病中眼瞼及結(jié)膜組織內(nèi)促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)的變化特點(diǎn)及其性別特異性

2、差異，同時(shí)對消退素D1在實(shí)驗(yàn)性干眼愈合階段對眼表病變的影響及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行分析和研究。
　　方法：
　　1.干眼鼠模型的建立及其有效性評價(jià)
　　選取實(shí)驗(yàn)動物6-8周齡C57BL/6雌鼠20只。隨機(jī)分為4組，其中3組分別建立3、5及10天干眼鼠模型，另一組設(shè)為正常對照。溫度、濕度和風(fēng)速分別控制在24-28℃、30％-35%和15L/min，用以模擬干燥環(huán)境。同時(shí)小鼠皮下注射氫溴酸東莨菪堿（1mg/100μl）以減少其自身淚

3、液分泌。對照組小鼠置于正常環(huán)境中（溫度24-28℃、濕度40%-50%，無氣流），無任何藥物干預(yù)。角膜上皮熒光染色評分，淚液分泌量及結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度等為有效性評價(jià)指標(biāo)。
　　2.干眼對于眼瞼組織中脂質(zhì)介質(zhì)的影響及其性別差異性的研究
　　在第一部分研究基礎(chǔ)上，建立鼠干眼模型。選取雌雄小鼠各15只，隨機(jī)分為正常對照組、造模5天組和10天組。使用LC-MS/MS系統(tǒng)對樣本進(jìn)行脂質(zhì)分析。利用髓過氧化酶（MPO）活性實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)，

4、實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）及組織學(xué)觀察等手段研究干眼對組織中細(xì)胞及分子水平的影響。
　　3.消退素RvD1在實(shí)驗(yàn)性干眼愈合階段對眼表病變的影響及調(diào)控作用
　　選取實(shí)驗(yàn)動物6-8周齡C57BL/6雌鼠20只，隨機(jī)分為正常對照組，干眼造模10天組，RvD1干預(yù)愈合組，及愈合對照組。其中兩個(gè)愈合組的小鼠在經(jīng)過10天造模處理后，放回正常環(huán)境中，并分別在5天愈合期內(nèi)給予RvD1或安慰劑利用MPO活性實(shí)驗(yàn)和

5、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測PMN和CD4+T細(xì)胞在淚腺組織中的含量。
　　結(jié)果：
　　1.在實(shí)驗(yàn)動物眼，小鼠角膜上皮熒光染色評分中，造模5天組與正常對照組相比，從（0.8±0.49）分上升至（6.35±0.03）分，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。淚液分泌量在造模3天、5天和10天組中與對照組相比均有顯著性下降。組織學(xué)切片顯現(xiàn)上瞼、穹窿結(jié)膜杯狀細(xì)胞在造模組內(nèi)數(shù)量減少，且胞漿較小。對照組結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度為（26.92±1.10）個(gè)

6、/100μm，造模10天組僅為（17.73±1.65）個(gè)/100μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.正常雌雄小鼠的眼瞼及結(jié)膜組織中檢測到促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)的表達(dá)。其中，DHA，17-HDHA及LXA4在雌鼠眼瞼中的含量明顯高于雄鼠（P<0.0232）。與正常對照組相比，雌鼠在造模5天后，其結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度比對照組下降(35.34±0.06)%，而雄鼠造模5天時(shí)結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度比其對照組下降(51.09±0.02)%。

7、同時(shí)，催化促炎性脂質(zhì)介質(zhì)合成的環(huán)氧化酶COX-2 mRNA在雌雄干眼模型鼠的眼瞼中相對表達(dá)量比正常對照組分別增加了（17.20±3.57）倍和（14.9±2.22）倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.003）。在干眼影響下，花生四烯酸（AA）源性促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)（LXA4）在雄鼠眼瞼中的表達(dá)量明顯高于雌鼠（P=0.02），而ω-3多不飽和脂肪酸源性促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)（DHA、4-HDHA、17-HDHA）在干眼雌鼠中的含量多于雄鼠（P<

8、0.02）。細(xì)胞學(xué)分析顯示，雌鼠結(jié)膜中被CD45和Ly6G抗體共同標(biāo)記的PMN數(shù)量較正常對照組高3倍(n=5)。而在雄鼠中，結(jié)膜中PMN數(shù)量在對照組中為1.91%，而在造模第5天時(shí)下降到0.48%，較正常組減少了75%(n=5)。
　　3.RvD1干預(yù)愈合組及愈合對照組小鼠的淚液分泌量在愈合期逐漸升高，并于愈合期第5天恢復(fù)至正常水平。愈合期第1天，RvD1干預(yù)組的淚液分泌量為（1.42±0.23）mm，而愈合對照組為（1.04±0

9、.22）mm，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.02）。此外，RvD1干預(yù)組中CD4+T細(xì)胞在淚腺中的數(shù)量為4.9%，在干眼造模10天組和愈合對照組中分別為16.2%和19.5%。RvD1干預(yù)愈合組中結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度以及淚腺組織中PMN數(shù)量與愈合對照組相比均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.研究中建立的小鼠模型具有干眼病的特征性眼表病理變化，對于干眼病的實(shí)驗(yàn)性研究具有一定價(jià)值。
　　2.本研究首次揭示了正常眼瞼及結(jié)膜