低表達(dá)Semaphorin6C通過激活PI3K-AKT信號(hào)通路減少顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間連接從而加速卵泡的閉鎖.pdf

1、目的:卵泡發(fā)育過程中Semaphorin6C的表達(dá)隨著年齡的增加呈降低趨勢(shì)，提示Semaphorin6C在卵巢衰老過程中扮演重要角色，且衰老卵巢中卵泡閉鎖率顯著增加，因完整的細(xì)胞連接是卵泡發(fā)育的必備前提，為進(jìn)一步探索細(xì)胞連接是否參與卵泡閉鎖的發(fā)生及其發(fā)生機(jī)制，通過下調(diào)Sema6C表達(dá)檢測(cè)其在卵泡閉鎖中細(xì)胞連接的改變并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法:選取14天C57小鼠30只為研究對(duì)象，體式顯微鏡下針刺分離竇前卵泡3D方法培養(yǎng)，以保持

2、卵泡形態(tài)。分別予以Sema6C-SiRNA和無意義Negative-SiRNA對(duì)竇前卵泡進(jìn)行處理，培養(yǎng)72小時(shí)，光學(xué)顯微鏡下觀察各組卵泡生長(zhǎng)狀況和閉鎖率；采用電子顯微鏡和熒光黃顯微注射技術(shù)形態(tài)學(xué)上觀察卵泡中顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間細(xì)胞連接改變；運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)比較各組卵泡細(xì)胞連接分子Connexin37、β-catenin的mRNA表達(dá)情況；Western blot技術(shù)檢測(cè)各組卵泡Sema6C、PI3K/AKT、Conne

3、xin37、β-catenin、Bax、Bcl-2分子蛋白水平表達(dá)情況；TUNEL檢測(cè)各組卵泡顆粒細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:Si-Sema6C干預(yù)竇前卵泡后，發(fā)現(xiàn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育受限，閉鎖增加，而對(duì)照組卵泡生長(zhǎng)發(fā)育完好，閉鎖相對(duì)降低；進(jìn)而電鏡和熒光黃微注射結(jié)果顯示干預(yù)組顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間細(xì)胞連接較對(duì)照組形態(tài)學(xué)顯示微絨毛倒伏，突觸減少，且在mRNA和蛋白水平上，干預(yù)組相關(guān)細(xì)胞連接分子Connexin37、β-catenin表達(dá)明顯低于