R-spondin 2-LGR4増強Wnt-p-catenin信號通路促進骨質疏松后骨重建的機制研究.pdf

1、第一部分：R-spondin2促進骨形成的機制研究
　　目的：
　　R-spondin2是最新發(fā)現的W n t信號激動劑R-spondins蛋白家族成員之一。本研究的目的是通過體外細胞研究觀察重組人R-spondin2蛋白因子對經典的W n t信號通路活性、礦化結節(jié)和成骨細胞標志基因表達的影響。
　　材料與方法：
　　成骨前細胞MC3T3-E1誘導成骨培養(yǎng)，不同濃度重組R-spondin2、Dkk-K W nt3

2、a蛋白因子處理細胞。Westem-blot檢測Wnt信號通路相關蛋白（活性卩-catenin、磷酸化-Lrp5)表達；ALP染色和活性測定實驗檢測A L P活性，Real-time P C R和 Westem-blot分別檢測成骨細胞標志基因mRNA和蛋白表達；Alizarin Red檢測礦化結節(jié)形成；熒光素酶報告基因檢測W nt信號活性。
　　結果：
　　不同濃度重組R-spondin2蛋白因子處理MC3T3-E1細胞，A

3、 L P活性明顯升髙，并且在100ng/ml濃度時達到平臺期，礦化結節(jié)的數量和面積明顯增加，同時成骨細胞標志基因OPG、Osterix和 Runx2表達明顯升髙，但是 RANKL基因表達未受影響，RANKL/OPG比值降低。Western b lo t檢測發(fā)現R-spondin2處理的細胞中活性P-catenin蛋白表達水平明顯升高，細胞免疫熒光提示活性P-catenin蛋白由細胞楽向細胞核內轉移。而當加入Dkk-1時，R-spondi

4、n2促進活性P-catenin蛋白表達的作用受到抑制，同時成骨相關基因表達、礦化結節(jié)形成、A L P活性和W n t信號活性受到抑制；加入W n t3 a時，活性P-catenin蛋白表達進一步增強，同時成骨相關基因表達、礦化結節(jié)形成、A L P活性和W n t信號活性進一步明顯增強。熒光素酶報告實驗提示R-spondin2對W n t信號的活性有積極的影響，同時加入低劑量的Wnt3a，能夠顯著放大W n t信號活性，然而Dkk-1能夠

5、明顯消除R-spondin2對W n t信號活化作用。
　　結論：
　　R-spondin2能夠通過活化經典W n t信號通路，促進成骨細胞分化和成熟，誘導骨形成。
　　第二部分：L G R4在R-spondin2調節(jié)骨形成過程中作用研究
　　目的：
　　目前研究認為L G R4為 R-spondins的二級受體。本研究的目的是觀察L G R4在 R-spondin2誘導骨形成過程中的作用。
　　材料

6、與方法：
　　分離和培養(yǎng)原代骨髓間充質干細胞（BMCs)，Real-time PCR檢測BMCs和 MC3T3-E1細胞中LGR4，5,6基因表達。不同濃度R-spondin2刺激MC3T3-E1細胞，Westem-blot檢測磷酸化-CREB和 A tf4蛋白表達。構建 LGR4 shRNA慢病毒建立穩(wěn)定的LGR4_/_MC3T3-E1細胞系，100ng/ml重組R-spondin2蛋白因子刺激LGR4_AMC3T3-E1細胞，

7、誘導成骨分化，Alizarin Red染色檢測礦化結節(jié)形成，A L P染色和A L P活性測定檢測A L P活性變化，Real-time P C R和 Westem-blot檢測成骨細胞標志基因表達，Westem-blot檢測磷酸化-Lrp5、ZNRF3、活性p-catenin蛋白表達’熒光素酶報告基因檢測W nt信號活性。
　　結果：
　　Real-time P C R結果提示B M C s和 MC3T3-E1細胞中L G

8、 R4基因表達水平顯著高于LGR5、LGR6基因表達水平。Westem-blot分析發(fā)現R-spondin2對磷酸化-CREB和Atf4蛋白表達無明顯影響。干擾MC3T3-E1細胞的LGR4基因功能，對 LGR5和 LGR6蛋白表達無明顯影響，但是R-spondin2失去對礦化結節(jié)形成、A L P活性以及成骨細胞標志基因表達的積極誘導作用，同時R-spondin2失去了對W n t信號通路相關蛋白磷酸化-Lrp5和活性P-catenin

9、蛋白表達的促進作用，并且R-spondin2失去對Z N R F3蛋白表達的抑制作用。盡管L G R4基因缺失，R-spondin2仍然能夠對礦化結節(jié)形成、A L P活性和成骨細胞標志基因的表達存在輕微的促進作用。這些結果提示，R-spondin2可能通過替換受體L G R5和L G R6發(fā)揮作用。熒光素酶報告基因進一步證實，R-spondin2對LGR4_aMC3T3-E1細胞中的W n t信號活性無明顯影響。
　　結論：

10、>　　L G R4在 R-spondin2活化W n t信號通路，調節(jié)成骨細胞分化和成熟，促進骨形成的過程中扮演關鍵的受體作用。
　　第三部分：R-spondin2調節(jié)破骨細胞分化成熟的機制研究
　　目的：
　　骨形成的過程中需要成骨細胞和破骨細胞共同參與。本研究的目的是觀察外源性R-spondin2蛋白因子對破骨細胞分化和成熟的影響。
　　材料和方法：
　　建立成骨細胞/破骨細胞共培養(yǎng)體系，100ng/m

11、l R-spondin2蛋白因子加入到共培養(yǎng)體系中，ELISA檢測培養(yǎng)液中OPG、RANKL蛋白濃度變化，TRAP染色觀察多核細胞，23個核被認為是破骨細胞，顯微鏡計數，Real-time P C R檢測破骨細胞分化標志基因T r a p和破骨細胞融合相關基因Cd47表達變化；同時加入重組RANKL蛋白因子，中和R-spondin2介導分泌的OPG蛋白，TRAP染色觀察多核細胞，顯微鏡計數，Real-time P C R檢測Trap和

12、Cd47基因表達變化。建立LGR4 A MC3T3-E1細胞/破骨細胞共培養(yǎng)體系，100ng/ml R-spondin2蛋白因子加入到共培養(yǎng)體系中，ELISA檢測培養(yǎng)液中OPG、RANKL蛋白濃度變化，TRAP染色觀察多核細胞，顯微鏡計數，Real-time PCR檢測Trap和 Cd47基因表達變化。破骨細胞單獨培養(yǎng)，100ng/ml R-spondin2刺激細胞，TRAP染色觀察多核細胞，顯微鏡下計數，Real-time PCR檢測

13、Trap和Cd47基因表達變化。
　　結果：
　　R-spondin2刺激共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)液中O P G蛋白濃度明顯升高，而 R A N K L蛋白濃度無明顯變化，RANKL/OPG比值降低，破骨細胞標志基因Trap和 Cd47表達降低，破骨細胞分化和成熟受到抑制，破骨細胞數量明顯減少；加入RANKL蛋白因子，破骨細胞數量明顯增加，Trap和 Cd47表達明顯升高，R-spondin2對破骨細胞分化和成熟的抑制作用被中和。當

14、 LGR4_AMC3T3-E1細胞/破骨細胞共培養(yǎng)時，破骨細胞數量明顯增加，Trap和 Cd47表達明顯升高，R-spondin2對破骨細胞分化和成熟的抑制作用消失。而當破骨細胞單獨培養(yǎng)時，R-spcmdin2對破骨細胞分化和成熟無明顯影響。
　　結論：
　　R-spondin2抑制破骨細胞形成需要L G R4基因功能正常表達的成骨細胞存在。
　　第四部分：R-spondin2對卵巢切除骨質疏松小鼠骨代謝和骨微結構影響

15、的觀察研究
　　目的：
　　體外實驗證實外源性R-spondin2蛋白因子能夠促進骨形成。本研究的目的是體內注射外源性R-spondin2蛋白因子，觀察卵巢切除骨質疏松小鼠骨代謝和骨微結構的變化。
　　材料和方法：
　　72只雌性6周齡C57BL/6J小鼠隨機分為卵巢切除組、卵巢切除+R-spondin2組、假手術組、假手術+R-spondin2組，皮下注射重組R-spondin2蛋白因子8周后，E L I S

16、A檢測血清O C N、Tracp5b、OPG和 RANKL蛋白濃度，TRAP染色和ALP染色分別檢測脛骨近端骨小梁周圍破骨細胞和成骨細胞數量及面積變化，鹽酸四環(huán)素鹽標記檢測骨礦化沉積率（MAR)和新骨形成率（B F R)，免疫組織化學分析腰椎骨小梁周圍成骨細胞中活性P-catenin蛋白表達，microCT分析脛骨近端骨微結構變化。
　　結果：
　　R-spondin2治療卵巢切除小鼠8周后，血清O C N、Tracp5b、

17、O P G和 R A N K L水平被逆轉，RANKL/OPG比值降低，骨小梁周圍破骨細胞數量和面積明顯減少，M A R和 B F R明顯增加，骨微結構明顯改善。盡管骨小梁周圍成骨細胞的數量和面積增加趨勢并不明顯，但是成骨細胞中活性p-catenin蛋白水平明顯增加。同時，R-spondin2促使正常小鼠的骨合成代謝增加，脛骨近端破骨細胞數量和面積減少，骨微結構參數BV/TV、Tb.N和Tb.Th明顯增加，Tb.Sp明顯降低。