豬第一極體發(fā)育功能的研究.pdf

1、本試驗以屠宰場廢棄的豬卵巢卵母細胞為試驗材料，主要對有腔卵母細胞的采集、卵母細胞體外成熟培養(yǎng)、第一極體(PbI)的排出時間、保存、活性鑒定以及分離方法、PbI重組MⅡ期卵母細胞的顯微操作術、重組卵母細胞的體外受精(包括單精子胞質內顯微注射)及其受精卵體外發(fā)育培養(yǎng)等進行了較系統(tǒng)的探索性研究，以期初步建立一整套豬PbI的分離、保存、重組、體外受精與體外發(fā)育的系統(tǒng)技術程序，為進一步深入開展豬和其他動物極體基因資源的研究及利用奠定基礎。取得主要

2、結果如下： 1.建立了豬卵巢卵母細胞體外成熟、體外受精及其胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)與技術。探討了不同發(fā)育階段(直徑大小)卵泡卵母細胞、不同培養(yǎng)系統(tǒng)與添加成分以及不同培養(yǎng)時間等關鍵因素對豬卵母細胞WM的影響。實驗證明，采用mTCM199作為基礎成熟培養(yǎng)系統(tǒng)液，并添加Φ5-8 mm卵泡液(pFF)和雌二醇(E2)，Φ2-8 mm卵巢卵泡COCs經IVM40h可得到較高的成熟率和IVF后體外發(fā)育卵裂率。 2.建立了一套豬PbI保存

3、和活力(細胞化學與形態(tài)學)鑒定的方法。分別對體外成熟培養(yǎng)過程中卵母細胞排出PbI規(guī)律、極體活性及其形態(tài)學變化進行了觀察、分析與評價；發(fā)現(xiàn)卵泡卵母細胞IVM40h后可得到大量高活性PbI；39℃條件下大多數(shù)采集的PbI存活時間僅有4 h，4℃條件下保存40 h存活率可達85.0％；-20℃保存1 wk達95.0％，而超低溫冷凍長期保存存活率和形態(tài)正常率分別達89.1％和97.8％。 3.利用顯微操作技術，建立了豬PbI的分離以及P

4、bI與卵母細胞重組的方法。Pbl分離后將其核物質顯微注射入去核卵母細胞胞質內，重組卵母細胞。結果表明，顯微操作分離極體效果顯著優(yōu)于酶消化法，且分離的PbI活力高，完整性好；使用含CCB的DPBS操作液可以得到重組成功率達87.2％。 4.建立了豬新鮮和冷凍的PbI重組卵母細胞體外受精及其胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)與技術，成功地獲得了豬重組卵母細胞體外受精后的2=細胞和4-細胞胚胎。實驗結果表明，新鮮和冷凍PbI重組卵母細胞后均可以進一