大連紫海膽KLF8、KLF10、KLF13基因的克隆與表達(dá)及C-EBPs基因啟動(dòng)子活性研究.pdf

1、大連紫海膽（Strongylocentrotus nudus）是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)物種，其性腺富含多種不飽和脂肪酸。然而大連紫海膽性腺脂類(lèi)物質(zhì)生成和脂肪酸合成的調(diào)控機(jī)制至今仍是空白。鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子（Krüppel-like factors，KLFs）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)已經(jīng)被證實(shí)在脂肪代謝中起調(diào)控作用。KLFs基因家族包含17個(gè)成員，其中KLF15，K

2、LF4，KLF5，KLF6和KLF9促進(jìn)脂肪形成，KLF2和KLF3抑制脂肪形成。C/EBPs基因家族包含6個(gè)成員(C/EBPα，C/EBPβ，C/EBPγ，C/EBPδ，C/EBPε和C/EBPζ)，其在調(diào)控脂肪形成中是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。闡明大連紫海膽KLFs基因的功能和C/EBPs基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及KLFs與C/EBPs的互作調(diào)控機(jī)制，對(duì)了解大連紫海膽脂類(lèi)物質(zhì)形成機(jī)理的研究具有重要的意義。
　　本研究篩選轉(zhuǎn)錄組中的脂類(lèi)物質(zhì)形

3、成相關(guān)基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物、構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體和逐段缺失載體，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、Genome Walking技術(shù)、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及生物信息學(xué)分析等，獲得了大連紫海膽KLF8、KLF10、KLF13全長(zhǎng)cDNA和部分C/EBPs基因序列及其5'側(cè)翼序列，分析了它們的序列特征和組織表達(dá)分布，并且對(duì)它們?cè)谥?lèi)物質(zhì)形成中的功能進(jìn)行了相關(guān)的探索，得到了以下結(jié)果:
　　1、SnKLF8cDNA全長(zhǎng)為3954bp，包含97b

4、p5'非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)和2684bp3'UTR，開(kāi)放閱讀框1164bp，編碼387個(gè)氨基酸。SnKLF10cDNA全長(zhǎng)為3526bp，包含138bp5'UTR和1912bp3'UTR，開(kāi)放閱讀框1476bp，編碼491個(gè)氨基酸。SnKLF13cDNA全長(zhǎng)為3756bp，包含422bp5'UTR和2485bp3'UTR，開(kāi)放閱讀框894bp，編碼282個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明SnKLF8、SnK

5、LF10和SnKLF13碳端都包含一個(gè)三聯(lián)竄的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
　　2、獲得了部分SnC/EBPs cDNA序列及完整的SnC/EBPs5'側(cè)翼序列。SnC/EBPα5'側(cè)翼序列為1154bp，SnC/EBPγ5'側(cè)翼序列為1494bp，SnC/EBPζ5'側(cè)翼序列為823bp。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ碳端都包含一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(Basic-leucine zipper doma

6、in,bZIP)。
　　3、SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13和SnC/EBPs mRNA在雄性性腺和雌性性腺的表達(dá)量相對(duì)較高，并且在兩齡和三齡雌雄性腺的mRNA表達(dá)存在差異。
　　4、SnKLF8和SnKLF10過(guò)表達(dá)，檢測(cè)SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ啟動(dòng)子的熒光活性不同程度的下降，表明SnKLF8和SnKLF10過(guò)表達(dá)抑制SnC/EBPs轉(zhuǎn)錄活性。SnKLF13過(guò)表達(dá)，檢測(cè)SnC/EBP

7、α啟動(dòng)子熒光活性升高，SnC/EBPγ和SnC/EBPζ啟動(dòng)子熒光活性下降，表明SnKLF13提高SnC/EBPα轉(zhuǎn)錄活性，抑制SnC/EBPγ和SnC/EBPζ轉(zhuǎn)錄活性。
　　5、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步表明SnC/EBPs是SnKLFs轉(zhuǎn)錄因子潛在的靶基因。
　　6、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明SnC/EBPα核心啟動(dòng)子位于-204～-16序列之間，

8、SnC/EBPγ包含兩個(gè)核心啟動(dòng)子位于-1396～-1179序列和-742～-525序列之間，SnC/EBPζ核心啟動(dòng)子位于164～609序列之間。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13和SnC/EBPs基因參與大連紫海膽性腺脂類(lèi)物質(zhì)的形成，并且SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13發(fā)揮功能是依靠調(diào)控SnC/EBPs轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這將為進(jìn)一步理解KLF8、KLF10、KLF13和C/EBPs基因