大連紫海膽KLF8、KLF10、KLF13基因的克隆與表達及C-EBPs基因啟動子活性研究.pdf

1、大連紫海膽（Strongylocentrotus nudus）是中國重要的經濟水產物種，其性腺富含多種不飽和脂肪酸。然而大連紫海膽性腺脂類物質生成和脂肪酸合成的調控機制至今仍是空白。鋅指樣轉錄因子（Krüppel-like factors，KLFs）和CCAAT增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)已經被證實在脂肪代謝中起調控作用。KLFs基因家族包含17個成員，其中KLF15，K

2、LF4，KLF5，KLF6和KLF9促進脂肪形成，KLF2和KLF3抑制脂肪形成。C/EBPs基因家族包含6個成員(C/EBPα，C/EBPβ，C/EBPγ，C/EBPδ，C/EBPε和C/EBPζ)，其在調控脂肪形成中是一個關鍵的轉錄因子。闡明大連紫海膽KLFs基因的功能和C/EBPs基因的轉錄調控以及KLFs與C/EBPs的互作調控機制，對了解大連紫海膽脂類物質形成機理的研究具有重要的意義。
　　本研究篩選轉錄組中的脂類物質形

3、成相關基因序列，設計特異性引物、構建過表達載體和逐段缺失載體，結合實時熒光定量PCR技術、Genome Walking技術、雙熒光素酶報告基因實驗以及生物信息學分析等，獲得了大連紫海膽KLF8、KLF10、KLF13全長cDNA和部分C/EBPs基因序列及其5'側翼序列，分析了它們的序列特征和組織表達分布，并且對它們在脂類物質形成中的功能進行了相關的探索，得到了以下結果:
　　1、SnKLF8cDNA全長為3954bp，包含97b

4、p5'非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)和2684bp3'UTR，開放閱讀框1164bp，編碼387個氨基酸。SnKLF10cDNA全長為3526bp，包含138bp5'UTR和1912bp3'UTR，開放閱讀框1476bp，編碼491個氨基酸。SnKLF13cDNA全長為3756bp，包含422bp5'UTR和2485bp3'UTR，開放閱讀框894bp，編碼282個氨基酸。結構域預測表明SnKLF8、SnK

5、LF10和SnKLF13碳端都包含一個三聯(lián)竄的鋅指DNA結合結構域。
　　2、獲得了部分SnC/EBPs cDNA序列及完整的SnC/EBPs5'側翼序列。SnC/EBPα5'側翼序列為1154bp，SnC/EBPγ5'側翼序列為1494bp，SnC/EBPζ5'側翼序列為823bp。結構域預測表明SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ碳端都包含一個亮氨酸拉鏈結構域(Basic-leucine zipper doma

6、in,bZIP)。
　　3、SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13和SnC/EBPs mRNA在雄性性腺和雌性性腺的表達量相對較高，并且在兩齡和三齡雌雄性腺的mRNA表達存在差異。
　　4、SnKLF8和SnKLF10過表達，檢測SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ啟動子的熒光活性不同程度的下降，表明SnKLF8和SnKLF10過表達抑制SnC/EBPs轉錄活性。SnKLF13過表達，檢測SnC/EBP

7、α啟動子熒光活性升高，SnC/EBPγ和SnC/EBPζ啟動子熒光活性下降，表明SnKLF13提高SnC/EBPα轉錄活性，抑制SnC/EBPγ和SnC/EBPζ轉錄活性。
　　5、生物信息學預測SnC/EBPα、SnC/EBPγ和SnC/EBPζ啟動子的轉錄因子結合位點，進一步表明SnC/EBPs是SnKLFs轉錄因子潛在的靶基因。
　　6、雙熒光素酶報告基因實驗表明SnC/EBPα核心啟動子位于-204～-16序列之間，

8、SnC/EBPγ包含兩個核心啟動子位于-1396～-1179序列和-742～-525序列之間，SnC/EBPζ核心啟動子位于164～609序列之間。
　　以上實驗結果表明，SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13和SnC/EBPs基因參與大連紫海膽性腺脂類物質的形成，并且SnKLF8、SnKLF10、SnKLF13發(fā)揮功能是依靠調控SnC/EBPs轉錄來實現(xiàn)的。這將為進一步理解KLF8、KLF10、KLF13和C/EBPs基因