家蠶BmVps4和BmVta1功能的初步研究.pdf

1、ESCRT（endosomal sorting complex required for transport）蛋白質(zhì)復合物廣泛存在于真核生物中，在進化上也是比較保守的，參與胞質(zhì)分裂、病毒出芽、自噬、質(zhì)膜損傷的修復、核膜重整、信號轉(zhuǎn)導調(diào)控等多種重要生命活動，與癌癥、神經(jīng)退行性疾病也有密切關系。ESCRT復合物系統(tǒng)中的一個重要蛋白是ATP酶Vps4，常與其正調(diào)控因子Vta1一起，在ESCRT完成功能后負責解離這些復合物以重復利用。目前研究主

2、要在哺乳動物和酵母細胞中進行，在家蠶等昆蟲中的研究還比較少。本論文以Vps4和Vta1在家蠶中的同源基因及編碼蛋白為研究對象，進行了初步的研究，主要結(jié)果如下：
　　1.用生物信息學方法，分析家蠶基因組信息，確認了BmVps4、BmVta1的編碼基因（SGD中登錄號分別為BGIBMGA006243、BGIBMGA004694）。BmVps4、BmVta1分別編碼438、311個氨基酸，蛋白相對分子量分別為49 kDa、34 kDa。

3、BmVps4、BmVta1基因分別位于家蠶第6號和22號染色體上。BmVps4蛋白具有保守的MIT結(jié)構(gòu)域、AAA結(jié)構(gòu)域、β片層以及C端螺旋。BmVta1蛋白具有保守的MIT結(jié)構(gòu)域以及VSL結(jié)構(gòu)域。通過序列比對和進化樹分析，發(fā)現(xiàn)BmVps4和BmVta1在進化上也是高度保守的。
　　2.采用PCR法克隆了BmVps4和BmVta1基因，構(gòu)建大腸桿菌表達載體pET-30a(+)-BmVps4和pET-30a(+)-BmVta1，在大腸

4、桿菌BL21(DE3)中成功表達了BmVps4和BmVta1的重組蛋白。
　　3.用重組蛋白作為抗原免疫小鼠，獲得了分別抗BmVps4和BmVta1的多克隆抗血清，能夠特異性的檢測在大腸桿菌中表達的相應重組蛋白及家蠶內(nèi)源蛋白，可以用來分析這兩個蛋白在家蠶不同發(fā)育階段及組織器官中的表達情況。
　　4.采用EGFP融合表達的方法，構(gòu)建基于昆蟲表達載體pIB/V5-His的重組表達質(zhì)粒pIB-BmVps4-egfp、pIB-egf

5、p-BmVta1，轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞，用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這2個重組蛋白均主要定位于細胞質(zhì)中。
　　5.應用熒光定量PCR、RT-PCR及Western blot分析BmVps4和BmVta1在家蠶不同發(fā)育階段及不同組織器官中的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的變化。二者的基因在家蠶整個生活周期中均有轉(zhuǎn)錄，且在胚胎發(fā)育和變態(tài)發(fā)育期達到最高水平；BmVps4在受精卵中轉(zhuǎn)錄水平最高，是其在1齡幼蟲中表達量的4倍；BmVta1在蠶蛾中轉(zhuǎn)錄水平最高

6、，是其在1齡幼蟲時的2倍。這兩種蛋白在家蠶生長發(fā)育過程中都有表達，特別在家蠶變態(tài)發(fā)育和胚胎發(fā)育階段有明顯的上調(diào)。因此，這兩個基因及其編碼蛋白可能在家蠶發(fā)育中發(fā)揮重要作用。另一方面，這兩個基因具有一定的組織器官表達特異性，在馬氏管、卵巢、精巢、神經(jīng)節(jié)、頭、脂肪體、中腸、絲腺、血淋巴中均有基因的轉(zhuǎn)錄，但在頭和血淋巴中基因轉(zhuǎn)錄水平達到最高。雖然Western blot結(jié)果進一步證實了這兩個蛋白在多種組織器官中的廣泛存在，但是二者都在卵巢和精巢

7、中表達量高，在頭部中表達量卻很少，在血淋巴中也沒有檢測到蛋白表達的信號，對這個現(xiàn)象我們正在優(yōu)化實驗條件進行進一步的研究中。
　　6.采用RNAi技術(shù)探究BmVps4在家蠶變態(tài)發(fā)育階段的作用。將人工合成的siRNA片段注射進入家蠶5齡第5天幼蟲體內(nèi)，能夠明顯降低BmVps4的mRNA水平，并顯著的遲滯了變態(tài)發(fā)育的進程。RNA干擾3天后，BmVps4基因的表達量下降了61％，相對于注射si-egfp的陰性對照組家蠶也下降了54%；家蠶

8、體重增長率僅有未注射組家蠶的56%，相當于注射si-egfp家蠶組的60%；化蛹時間也明顯延長，比未注射組延長50分鐘，比注射si-egfp的陰性對照組延長了40分鐘。RNAi處理13天后，蠶蛹的體重和體長均低于對照組家蠶，而且蠶繭明顯變小，繭絲較少。RNAi導致蠶蛾翅膀短小、伸展不開的比例明顯升高，高達30%，是未注射組的3倍，是注射si-egfp組的2倍。這些結(jié)果說明BmVps4在家蠶的變態(tài)發(fā)育過程中的確發(fā)揮了重要的作用。
　

9、　7.用家蠶核型多角體病毒BmNPV感染家蠶 BmN細胞，采用熒光定量PCR探索了BmVps4和BmVta1的基因轉(zhuǎn)錄變化情況。實時熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)， BmVps4的基因轉(zhuǎn)錄在病毒侵染后50、60、90分鐘階段有明顯的上調(diào)，但在50、60分鐘的上調(diào)程度要高于在90分鐘的上調(diào)程度；BmVta1則在20、60、90分鐘階段有明顯上調(diào)，但在90分鐘的上調(diào)程度要高于前2個時間點。這些發(fā)現(xiàn)表明， BmVps4和BmVta1與BmNPV的感染