基因工程抗體與紫杉醇聯(lián)用對(duì)BT474細(xì)胞的促凋亡作用及其機(jī)理研究.pdf

1、HER2/neu受體是EGFR家族成員中的第2號(hào)，在許多上皮腫瘤中過度表達(dá)，尤其是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和鼻咽癌等。HER2/neu基因編碼一個(gè)185KDa的跨膜蛋白，具有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三大結(jié)構(gòu)域。EGF樣配體觸發(fā)HER2/neu二聚復(fù)合物的形成，受體激活后發(fā)生自生磷酸化，并激活P13K/AKti金徑和Ras/MAPK途徑，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞的轉(zhuǎn)型、惡性增殖并增強(qiáng)遷移潛能。 研究表明，約30％的乳腺癌患者有HER2/neu基

2、因的擴(kuò)增和過度表達(dá)，HER2/neu受體的過度表達(dá)與腫瘤的分級(jí)、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。HER2過表達(dá)的乳腺癌惡性程度高、遷移性和侵潤(rùn)性強(qiáng)，這類患者對(duì)化療藥物不敏感，治療后易復(fù)發(fā)，總的存活期和無病生存期短。目前治療復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的惡性乳腺癌主要是化學(xué)療法，而化療藥物中首推紫杉醇，但針對(duì)p185高表達(dá)類的惡性乳腺癌卻折扣了包括紫杉醇在內(nèi)的化療藥物的療效。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)更有效的治療方案。由于HER2的表達(dá)水平直接與細(xì)胞癌化進(jìn)程有關(guān)，這

3、種極好的靶抗原促進(jìn)人們?nèi)グl(fā)現(xiàn)一種具有高度專一性的抗癌藥物。鑒于HER2定位于腫瘤細(xì)胞表面，且它在正常組織中表達(dá)量極低，使得它成為一個(gè)容易為藥物接近的靶分子。該研究組在以往的工作中己成功構(gòu)建了抗p185<'c-erbB-2/neu>單克隆抗體A21，并對(duì)它的可變區(qū)的基因序列進(jìn)行了克隆和序列分析，該將單抗的輕鏈和重鏈連接在一起構(gòu)建了單鏈抗體(scFv)，再將其與人的抗體IgG<,1>的恒定區(qū)Fc片段連接，構(gòu)建了scFv-Fc嵌合體，即p18

4、5<'cerbB-2/neu>基因工程抗體。隨后對(duì)基因工程抗體進(jìn)行了細(xì)胞增殖抑制作用的檢測(cè)，初步證明該抗體具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。 本研究旨在探討基因工程抗體與紫杉醇聯(lián)用可增強(qiáng)p185高表達(dá)人的乳腺癌細(xì)胞BT474對(duì)紫杉醇的敏感性，并在此基礎(chǔ)上探討p185高表達(dá)人的乳腺癌細(xì)胞BT474對(duì)紫杉醇耐藥性的分子機(jī)制。為臨床診斷和治療提供參考，以及為將基因工程抗體發(fā)展成為抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。 采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖的抑

5、制作用，TUNEL法和Annexin V-FITC/PI法分別定性和定量地檢測(cè)凋亡細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基因工程抗體與紫杉醇聯(lián)用組較基因工程抗體或紫杉醇單用組而言，對(duì)BT474增殖的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)，并顯著增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。采用IP和Westernblot分析HER2酪氨酸的磷酸化水平，Westernblot分析AKt、MAPK、NF-κB磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：紫杉醇組較基因工程抗體組或聯(lián)用組而言，HER2酪氨酸、AKt(Ser4

6、73)、p44/p42MAPK(Thr202/Tyr204)、NF-κB p65亞基磷酸化水平相對(duì)較高。采用EMSA分析NF-κB與DNA的結(jié)合活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度、不同處理時(shí)間條件下的紫杉醇組較基因工程抗體組或聯(lián)用組而言，NF-κB與DNA的結(jié)合活性均顯著增強(qiáng)。采用FACS分析DNA含量和細(xì)胞周期分布，SAS(9.0)軟件分析細(xì)胞S期百分比與增殖指數(shù)的關(guān)系。Westernblot分析CyclinD1、 VEGF及MMP-9表達(dá)水平