馬齒莧酰胺E對帕金森病模型的保護(hù)作用研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是世界第二大神經(jīng)退行性疾病。其主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺含量減少;其臨床表現(xiàn)為肌肉強(qiáng)直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)減少和步態(tài)異常。該病發(fā)病緩慢，呈進(jìn)行性加重，嚴(yán)重削弱了病人的運(yùn)動(dòng)能力。左旋多巴是目前臨床用于治療帕金森病的常用藥物，它可以補(bǔ)充多巴胺的不足從而緩解PD癥狀，但對神經(jīng)細(xì)胞并無保護(hù)作用，長期服用甚至?xí)a(chǎn)生較多副作用，因此治療帕金森病的藥物仍

2、有待開發(fā)。
　　馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，其具有涼血止血、清熱解毒等功效，而且還具有抗氧化、抗老年癡呆、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧提取物可以改善魚藤酮等多種神經(jīng)毒劑誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)能力、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增加紋狀體內(nèi)多巴胺含量。但是，馬齒莧提取物中抗PD藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。馬齒莧酰胺E(OleraceinE， OE)是本課題組從馬齒莧中提

3、取得到的四氫異喹啉生物堿，鑒于OE具有顯著的抗氧化作用，對大劑量D-半乳糖/亞硝酸鈉誘導(dǎo)的老年癡呆衰老小鼠模型具有緩解氧化應(yīng)激、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用，我們推測OE是馬齒莧抗PD的活性成分之一。本文評價(jià)了OE對魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的作用。
　　(1)利用5μM魚藤酮致毒SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞24 h建立PD體外細(xì)胞模型，10μM OE預(yù)孵2h再與魚藤酮共孵育24 h，檢測OE對魚藤酮致毒PD細(xì)胞模型的作用。通過

4、測定乳酸脫氫酶(LDH)逸漏率、TUNEL染色、DCFH-DA染色、JC-1染色，分別檢測細(xì)胞的生存率、凋亡率、細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及線粒體膜電勢;用免疫印跡法(western-blot)檢測細(xì)胞ERK信號(hào)通路中MEK1/2和ERK1/2激酶以及凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2、cytochromec、cleaved caspase-3的表達(dá)。結(jié)果表明，與空白對照組相比，5μM魚藤酮處理24 h后，SH-SY5Y細(xì)胞的LDH逸漏率顯著增加(

5、p＜0.001)、凋亡率顯著上升(p＜0.001)、ROS水平顯著升高(p＜0.001)、線粒體膜電勢明顯降低;與空白對照組比較，魚藤酮處理1h、12h、24 h時(shí)ERK信號(hào)通路中總的ERK含量沒有發(fā)生明顯變化或略微有些降低，但p-MEK、p-ERK表達(dá)明顯提高，在24 h時(shí)p-ERK表達(dá)具有顯著性差異(p＜0.001)。此外，凋亡相關(guān)蛋白bax/bcl-2比率(p=0.005)、cytochrome c(p＜0.001)以及cleav

6、edcaspase-3(p＜0.001)蛋白的表達(dá)都顯著增強(qiáng)。與魚藤酮模型組相比，10μM OE顯著降低了細(xì)胞LDH逸漏率(p＜0.001)、細(xì)胞凋亡率(p＜0.001)以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平(p＜0.001)，提高了細(xì)胞膜電勢;在魚藤酮處理1h、12h、24 h時(shí)，OE對p-MEK、p-ERK蛋白的表達(dá)都有抑制作用，在24 h時(shí)，對p-ERK蛋白表達(dá)的抑制作用最為顯著(p=0.002)，且顯著抑制bax/bcl-2(p=0.009)、c

7、ytochromec(p=0.012)以及cleaved caspase-3(p=0.003)蛋白的表達(dá)。
　　(2)采用C57BL-6J小鼠灌胃給魚藤酮（30 mg/kg/d）56天，建立了PD小鼠模型。藥物處理組分別灌胃給予高劑量OE(15 mg/kg/d)、低劑量OE(3 mg/kg/d)和陽性對照藥鹽酸司來吉蘭(10 mg/kg/d)56天。采用自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、步態(tài)實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的運(yùn)動(dòng)能力;測定小鼠中腦、紋狀體和血漿

8、中的SOD活力和MDA含量，評價(jià)小鼠的氧化應(yīng)激水平;酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色觀察小鼠中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元;免疫印記法(western-blot)檢測小鼠中腦和紋狀體ERK激酶的表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，魚藤酮模型組小鼠在自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)中30 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離顯著減少(p=0.028);在轉(zhuǎn)棒上的運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著減少(p=0.033);步態(tài)試驗(yàn)中，小鼠的前后肢配合指數(shù)與同側(cè)后足步幅顯著性減小(p＜0.001)，小鼠兩后

9、爪足掌距離(p=0.01)顯著性增加;小鼠紋狀體(p=0.031)和血漿(p＜0.001)中SOD活力顯著降低，中腦SOD活力雖然降低，但差異不顯著(p＞0.05);中腦(p=0.005)、紋狀體(p=0.045)和血漿(p＜0.001)中的MDA含量都顯著增加;免疫組化染色顯示小鼠中腦黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)(p=0.034)和TH陽性神經(jīng)纖維光密度值(p＜0.001)顯著性降低，樹突明顯變短或消失;此外，小鼠中腦(p=0.021)和

10、紋狀體(p＜0.001)p-ERK表達(dá)均顯著升高。與魚藤酮模型組相比，OE高劑量組小鼠的運(yùn)動(dòng)路程(p=0.001)、在轉(zhuǎn)棒上的運(yùn)動(dòng)時(shí)間(p=0.024)、前后肢配合指數(shù)(p=0.011)以及同側(cè)后足步幅(p=0.048)都顯著增加，小鼠兩后爪足掌距離減小但無顯著性差異(p＞0.05);小鼠中腦(p=0.007)、紋狀體(p=0.022)和血漿(p＜0.001)中的SOD活力顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著減少(p=0.005,p=0.015,p

11、＜0.001);小鼠中腦黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)(p=0.004)和TH陽性神經(jīng)纖維光密度值(p=0.001)顯著性升高，多巴胺能神經(jīng)元樹突增多;中腦(p=0.043)和紋狀體(p=0.037)中p-ERK表達(dá)均顯著減少，但凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2無顯著性變化(p＞0.05)。OE低劑量組小鼠與魚藤酮模型組相比，其前后肢配合指數(shù)(p=0.02)、同側(cè)后足步幅(p=0.016)都顯著升高，兩后爪足掌距離顯著減小(p=0.005)，小

12、鼠中腦黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)(p=0.025)和TH陽性神經(jīng)纖維光密度值(p=0.012)顯著性升高;但其中腦及紋狀體的生化指標(biāo)以及p-ERK的表達(dá)沒有顯著性差異。司來吉蘭陽性對照組可提高小鼠在轉(zhuǎn)棒上的運(yùn)動(dòng)時(shí)間(p=0.029)、前后肢配合指數(shù)(p=0.025)、同側(cè)后足步幅(p=0.029)，降低兩后爪足掌距離(p=0.004);提高血漿SOD活性(p=0.002)，降低血漿(p＜0.001)、中腦(p＜0.001)、紋狀體(p=0