深海細菌Geobacillus stearothermophilus TH10中嗜熱脂肪酶的表達鑒定及體外誘變研究.pdf

1、高溫酶因理論研究和工業(yè)應用上的雙重意義受到越來越廣泛的關注。研究高溫酶的適應機制不僅有助于解釋生命起源問題，而且對于工業(yè)用酶的開發(fā)有理論指導作用。 深海熱液口作為極端環(huán)境的一種，具有高溫高壓高還原物質(zhì)等特征，這也意味著其中蘊含著豐富獨特的微生物資源。它的開發(fā)對于高溫酶的研究具有重要意義。在生物催化劑的研究和應用中，微生物脂肪酶一直占據(jù)著非常重要的地位。高溫脂肪酶因熱穩(wěn)定性好，可以省略一些工業(yè)步驟從而大大節(jié)約制造成本，已廣泛應用

2、于食品、化妝品、皮革、飼料、廢物處理等領域。 我們從深海熱液硫化物樣品4143-1分離篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶菌株TH10，其最適生長溫度65℃，16s rRNA鑒定其為Geobacillus。 用Geobacillus脂肪酶保守序列設計引物，成功擴增得到TH10脂肪酶基因全長，克隆后于E.coli中重組表達，性質(zhì)檢測結果顯示其為高溫酶，最適酶活為80℃，即使在90℃仍然保持70％以上的活性。TH10脂肪酶偏堿性，在PH

3、8.0-9.0都有較高活性。在耐受金屬離子方面，該酶并沒有較大的優(yōu)勢，所有的金屬離子都不同程度的對酶活性起抑制作用。而在去污劑和酶抑制劑存在的條件下，TH10表現(xiàn)極大的耐受性，tween20和chaps對酶活性都有一定的提高作用。 Geobacillus TH10脂肪酶的三維模擬結構顯示，它具有脂肪酶共同的α/β三層結構，另外，存在一個由2個片狀結構和2個α螺旋組成的特殊結構區(qū)，是Geobacillus脂肪酶較保守的區(qū)域。溫

4、度較低時，該結構區(qū)覆蓋在催化區(qū)起保護作用。 TH10脂肪酶在用PNP底物檢測時表現(xiàn)僅對降解短鏈脂肪酸鏈有優(yōu)勢，以C2和C4為最適。通過和同源性最近的Staphylococcus比對，構建了三個突變子，Q142M，I347V，Q142M/I347V，通過對突變蛋白與野生型蛋白性質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)其對底物PNP-C2的活性增強，突變子D47V和Q142M/I347V的熱穩(wěn)定性有不同程度的提高。 目前，關于Geobacillus

5、脂肪酶的結構研究還不多，而定點突變技術需要建立在對目的蛋白的清楚認識和理性分析基礎上。另外，定點突變改變的氨基酸數(shù)量有限，而蛋白任一性質(zhì)都取決于多個氨基酸的相互作用。我們也嘗試用易錯PCR對TH10脂肪酶進行體外定向進化。初步結果表明，5mM的MgCl2可以控制易錯PCR的錯配率在合適的范圍，從降解PNP-C10的能力來看，文庫可能包含有益突變。這一結果有待驗證，相關的工作還在進行中。 我們從深海熱液硫化物樣品篩選到高產(chǎn)脂肪酶

6、菌株Geobacillus TH10。對其脂肪酶進行克隆表達，測定了系列酶學性質(zhì)。Geobacillus TH10脂肪酶相比其他已報道的Geobacillus屬來源的脂肪酶有更高的熱穩(wěn)定性，是進一步研究嗜熱脂肪酶的高溫適應機制和穩(wěn)定性較好的材料。利用定點突變技術研究了在該嗜熱脂肪酶底物特異性和熱穩(wěn)定性方面起關鍵作用的氨基酸，并試圖通過定向進化的方法找到能在降解長鏈脂肪酸方面有優(yōu)勢的突變子。已有的研究將為后期酶學性質(zhì)完善提供理論指導依據(jù)。