ETS1基因?qū)е聝煞N自身免疫性疾病易感的相關(guān)性分析及機(jī)制研究.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種常見(jiàn)的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，其發(fā)生受到生活環(huán)境、免疫環(huán)境及遺傳等多種因素影響;系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)也是一類(lèi)自身免疫性疾病，因其可以導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和組織損害引起患者多器官受累而一直備受關(guān)注。隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的興起，許多自身免疫性疾病的易感基因逐漸得以揭示，越來(lái)越多的證據(jù)表明易感基因及其多態(tài)位點(diǎn)在復(fù)雜疾病的發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。
　　眾所周知，ETS1作為一個(gè)經(jīng)典的原癌基因，在很多

2、侵襲性實(shí)體瘤，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和甲狀腺癌中表達(dá)都有一定程度的升高，也從側(cè)面說(shuō)明這一基因?qū)τ跈C(jī)體免疫系統(tǒng)的正常維持起到至關(guān)重要的作用。盡管已有研究證明ETS1是東亞人群SLE的疾病易感基因，但是其與其他自身免疫性疾病易感性方面的作用及具體分子機(jī)制尚未可知。針對(duì)ETS1基因與AS及SLE疾病易感性的關(guān)系、導(dǎo)致在患者與正常人群中基因表達(dá)差異的原因和該基因是通過(guò)調(diào)控哪些靶基因影響免疫應(yīng)答的關(guān)鍵通路進(jìn)而參與自身免疫性疾病的發(fā)生過(guò)程這

3、幾方面的問(wèn)題，我們進(jìn)行了以下三部分的研究:
　　第一部分 ETS1基因與強(qiáng)直性脊柱炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的關(guān)聯(lián)分析
　　為明確ETS1基因與中國(guó)北方漢族人群強(qiáng)直性脊柱炎疾病易感性之間的關(guān)系，本部分利用兩個(gè)人群進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，分別是2147名長(zhǎng)期生活于山東地區(qū)的漢族人群和752名長(zhǎng)期生活于寧夏回族自治區(qū)的漢族人群。山東地區(qū)人群中1015名強(qiáng)直性脊柱炎病例組個(gè)體均來(lái)自山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院及山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，診斷符合已修訂的紐約

4、強(qiáng)直性脊柱炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，同地區(qū)1132名對(duì)照組個(gè)體為山東大學(xué)齊魯醫(yī)院健康體檢中心同期隨機(jī)接受體檢的健康人群。寧夏回族自治區(qū)漢族人群病例組與對(duì)照組樣本均由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院楊澤教授提供。同時(shí)在兩個(gè)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收集無(wú)親緣關(guān)系的SLE病例組398名，同地區(qū)匹配健康對(duì)照480名作為正常對(duì)照組。根據(jù)GWAS報(bào)道及數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于中國(guó)人群該基因的連鎖不平衡情況，本研究選定了7個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP):rs12574073、rs1128334、rs493

5、7333、rs4254089、rs7951925、rs7116578及rs4937342位點(diǎn)用于病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析。
　　利用Sanger測(cè)序排除ETS1基因新發(fā)變異后，本研究利用TaqMan探針?lè)▽?duì)所選SNP位點(diǎn)進(jìn)行等位基因分型，結(jié)果顯示rs12574073、rs1128334和rs4937333位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在山東地區(qū)病例組和正常對(duì)照組中存在差異，但是只有rs1128334位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在病例組和

6、對(duì)照組中的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=1.204,95％置信區(qū)間為1.058-1.371,P=0.005），經(jīng)過(guò)Bonferroni校正后，rs1128334位點(diǎn)仍與強(qiáng)直性脊柱炎易感性相關(guān)(Pc=0.035)。位于同一連鎖不平衡區(qū)域的rs12574073、rs1128334及rs4937333位點(diǎn)危險(xiǎn)等位基因組成的TAT單體型與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)(OR值=1.24,95％置信區(qū)間為1.05-1.47,P=0.01)。隨后利

7、用寧夏回族自治區(qū)的漢族人群對(duì)rs1128334位點(diǎn)與強(qiáng)直性脊柱炎易感性的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明rs1128334位點(diǎn)等位基因A增加了疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.305,95％置信區(qū)間為1.055-1.615,P=0.015）。
　　在SLE病例組和對(duì)照組中對(duì)rs12574073、rs1128334及rs4937333位點(diǎn)進(jìn)行等位基因分型，顯示3個(gè)位點(diǎn)與SLE疾病易感性均相關(guān)(rs12574073:OR=1.593,95％置信區(qū)間為1

8、.290-1.968,P＜0.001; rs1128334:OR=1.832,95％置信區(qū)間為1.489-2.256,P＜0.001; rs4937333:OR=1.515,95％置信區(qū)間為1.240-1.850，P＜0.001)。
　　本部分研究結(jié)果利用兩個(gè)不同地區(qū)的人群，發(fā)現(xiàn)ETS1基因是中國(guó)北方漢族人群強(qiáng)直性脊柱炎的易感基因，位于該基因3'非翻譯區(qū)(UTR)的rs1128334位點(diǎn)與疾病易感的相關(guān)性最為顯著;同時(shí)證實(shí)ETS1

9、基因在山東地區(qū)漢族人群中也與SLE疾病易感性相關(guān)。
　　第二部分 ETS1基因?qū)е录膊∫赘械墓δ芪稽c(diǎn)鑒定
　　通過(guò)中國(guó)北方漢族人群自身免疫性疾病AS及SLE的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，可以確定ETS1基因是這兩種自身免疫性疾病的易感基因，并且位于3,UTR的rs1128334位點(diǎn)與疾病易感的相關(guān)性最為顯著，那么它是否是該基因引起疾病易感的功能位點(diǎn)呢？根據(jù)功能位點(diǎn)研究策略，我們首先檢測(cè)了兩種疾病患者體內(nèi)ETS1基因的表達(dá)情況（AS病例組:

10、50例，對(duì)照組:161例;SLE病例組:47例，對(duì)照組:66例），兩種疾病病例組外周血中ETS1基因的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組（P值均＜0.0001），證實(shí)ETS1基因在這兩種自身免疫性疾病的病例組和對(duì)照組中表達(dá)存在差異。
　　隨后我們檢測(cè)了rs1128334位點(diǎn)不同基因型健康個(gè)體(28名AA純合基因型、50名AG雜合基因型和83名GG純合基因型)ETS1基因的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA基因型個(gè)體ETS1基因的相對(duì)表達(dá)水平

11、顯著低于AG基因型和GG基因型(P=0.0024)，并且表達(dá)水平隨危險(xiǎn)等位基因A數(shù)目的增加而顯著降低。
　　通過(guò)結(jié)合歸因分析和文獻(xiàn)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)rs6590330位點(diǎn)作為致病功能位點(diǎn)的可能性顯著高于rs1128334位點(diǎn)。數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于兩個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡性分析表明rs6590330位點(diǎn)與rs1128334位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)(r2=0.97)，通過(guò)隨機(jī)對(duì)100名正常個(gè)體進(jìn)行兩位點(diǎn)測(cè)序比對(duì)，進(jìn)一步在我們研究的人群中證實(shí)兩者處于完全

12、連鎖不平衡狀態(tài)，因此我們將rs6590330位點(diǎn)作為引起疾病易感的候選功能位點(diǎn)進(jìn)行了研究。
　　通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因活性分析，我們發(fā)現(xiàn)攜帶rs6590330位點(diǎn)等位基因G的報(bào)告基因活性顯著高于等位基因A，且該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0265)。將包含等位基因A或G的序列片段與ETS1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游842bp的片段相連，共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，結(jié)果進(jìn)一步表明rs6590330位點(diǎn)等位基因G能夠使ETS1基因的轉(zhuǎn)錄活性明顯增加(

13、P=0.0006)，提示rs6590330位點(diǎn)不同等位基因可能影響ETS1基因的表達(dá)。
　　最后，我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因評(píng)估了轉(zhuǎn)錄因子Sp1與rs6590330位點(diǎn)不同等位基因結(jié)合對(duì)ETS1基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，當(dāng)高表達(dá)Sp1時(shí)，等位基因G的轉(zhuǎn)錄活性顯著升高，而敲低Sp1的表達(dá)水平后，與對(duì)照組相比攜帶等位基因G片段的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，但是對(duì)等位基因A沒(méi)有明顯影響，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與等位基因G結(jié)合使ETS1基因的轉(zhuǎn)錄活性增加并影響

14、ETS1的表達(dá)。
　　本部分研究證實(shí)了在AS和SLE病例組與正常對(duì)照組中ETS1基因表達(dá)水平存在差異，提示ETS1與疾病的發(fā)生有關(guān)，對(duì)rs1128334位點(diǎn)功能性研究排除了其對(duì)ETS1基因表達(dá)的影響，同時(shí)證實(shí)與rs1128334位點(diǎn)強(qiáng)連鎖不平衡的多態(tài)位點(diǎn)rs6590330不同等位基因通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合，引起ETS1基因表達(dá)水平的改變，進(jìn)而參與疾病的發(fā)生。
　　第三部分 通過(guò)ChIP-seq初步鑒定ETS1的靶基因

15、
　　為了全面的了解ETS1在免疫細(xì)胞中的靶向調(diào)控基因，我們利用ETS1表達(dá)水平較高的黑人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji進(jìn)行ChIP-seq（染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測(cè)序）技術(shù)獲得與ETS1特異性結(jié)合的基因組DNA片段，通過(guò)測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到與該蛋白結(jié)合的片段序列，隨后采用MACS軟件檢測(cè)富集信號(hào)的峰度并定位其在基因組中的位置。結(jié)果表明ETS1的靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)在染色體中的分布趨勢(shì)與染色體基因組容量一致，主要分布于第1、2

16、、3、4、5、6、7號(hào)染色體上。ETS1在基因組中的靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)與臨近基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)位置之間的關(guān)系為:13.37％位于TSS上游2 kb-20 kb之間（上游區(qū)域）、6.44％位于TSS上游2kb到下游2kb(啟動(dòng)子區(qū)域)、45.92％位于TSS上游20 kb以外（基因間區(qū)域）、32.64％位于內(nèi)含子區(qū)域，而僅有1.64％位于外顯子中，說(shuō)明ETS1既可以調(diào)控靶基因的基本啟動(dòng)子活性，又可以通過(guò)特異性結(jié)合在遠(yuǎn)距離調(diào)控區(qū)域影響靶

17、基因表達(dá)。應(yīng)用GO聚類(lèi)分析方法對(duì)靶基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)ETS1對(duì)參與細(xì)胞的代謝過(guò)程、生物合成、基因表達(dá)、細(xì)胞器構(gòu)成、核酸結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶的合成有關(guān)的基因均可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。通過(guò)KEGG通路分析提示ETS1對(duì)TRAF5、CREB3L4、CXCL5、TAB2、CREB5和CREBL2基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，提示ETS1可能通過(guò)TNF信號(hào)通路參與淋巴細(xì)胞死亡過(guò)程。
　　針對(duì)位于啟動(dòng)子區(qū)域的靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)的分析結(jié)果，我們隨機(jī)選取了10個(gè)

18、候選靶基因在Raji細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明ETS1可以與CDK9、YY1、IL-17RA、SOX4、CXCR5、PTPN12及GMPR2基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域結(jié)合。
　　本部分我們通過(guò)ChIP-seq技術(shù)初步鑒定得到多個(gè)與免疫系統(tǒng)功能相關(guān)的ETS1靶基因，ETS1通過(guò)對(duì)這些靶基因表達(dá)的調(diào)控，影響免疫應(yīng)答過(guò)程的多個(gè)通路，參與自身免疫反應(yīng)的過(guò)程;對(duì)淋巴細(xì)胞中ETS1靶基因進(jìn)行全面的分析也為臨床研究中自身免疫性疾病治療靶點(diǎn)