漢黃芩素調(diào)節(jié)Teff-Treg細(xì)胞活性對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎的影響及機(jī)制.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一組反復(fù)發(fā)作的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)，其發(fā)病率在全球呈逐年上升的趨勢(shì)。IBD的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為環(huán)境因素、遺傳易感性、腸道感染、免疫因素等共同參與了疾病的發(fā)生過程。炎性腸道組織大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)是IBD的重要病理學(xué)特征。

2、r>　　T細(xì)胞亞群中效應(yīng)性T細(xì)胞(Effector T cells，Teff)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)相互制衡、協(xié)調(diào)，共同維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡。漢黃芩素(Wogonin)為一種純天然黃酮類化合物，具有抗腫瘤和抗炎活性。為觀察漢黃芩素對(duì)局部腸道炎癥的作用，本研究基于右旋葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium salt，DSS)誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型觀察漢黃芩素對(duì)小鼠腸炎發(fā)病的影響以

3、及體內(nèi)Teff/Treg細(xì)胞功能的變化;其次體外分析了漢黃芩素對(duì)Teff/Treg細(xì)胞功能的直接影響;最后進(jìn)一步探討漢黃芩素調(diào)節(jié)Teff/Treg細(xì)胞功能活性的作用機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容分為2部分:
　　1.漢黃芩素對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎及Teff/Treg細(xì)胞功能活性的的影響
　　目的:觀察漢黃芩素對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎發(fā)病的影響，分析腸炎小鼠脾臟及腸道Teff/Treg細(xì)胞功能的變化，并體外分析漢黃芩素對(duì)Teff/Tre

4、g細(xì)胞功能的直接影響。
　　方法:采用2.5％ DSS溶液誘導(dǎo)C57BL/6小鼠腸炎模型，腹腔注射不同劑量漢黃芩素（50 mg/kg、100 mg/kg），觀察小鼠的體重、血便、腹瀉等情況計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞的頻率及腸道組織CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞的頻率和細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。給C57BL/6正常小鼠腹腔注射不同劑量漢黃芩素，觀察漢黃芩素對(duì)正常

5、小鼠的影響。磁珠分選CD4+、CD8+T細(xì)胞，經(jīng)不同濃度漢黃芩素體外刺激后qRT-PCR檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞IFN-γ mRNA的表達(dá)水平。CD8+T細(xì)胞經(jīng)不同濃度漢黃芩素刺激后與小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系MC-38共孵育，分析CD8+T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。磁珠分選CD4+CD25-T細(xì)胞，加入anti-CD3、anti-CD28、IL-2及TGF-β，不同濃度漢黃芩素體外作用于TGF-β誘導(dǎo)生成的CD4+CD25+T細(xì)胞(Ti-Tr

6、eg)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)漢黃芩素處理后CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞頻率的變化。
　　結(jié)果:體內(nèi)腹腔注射不同劑量漢黃芩素(50 mg/kg、100 mg/kg)均可加劇DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎的發(fā)病，小鼠體重下降更劇烈，腸腔狹窄、腸道短縮及腸道壞死現(xiàn)象明顯，漢黃芩素100 mg/kg處理組效果最為顯著;腹腔注射不同劑量漢黃芩素對(duì)C57BL/6正常小鼠無(wú)明顯影響。與對(duì)照組相比，漢黃芩素聯(lián)合DSS刺激組小鼠脾臟中CD4+CD25+Fo

7、xp3+、CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞的頻率顯著下降，腸道組織CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞的頻率及細(xì)胞絕對(duì)數(shù)均明顯下降。漢黃芩素體外刺激可提高CD8+T細(xì)胞殺傷MC-38靶細(xì)胞的活性，且CD4+、CD8+T細(xì)胞IFN-γ mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高。TGF-β體外誘導(dǎo)生成的CD4+CD25+T細(xì)胞經(jīng)漢黃芩素處理后，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的頻率明顯下降。
　　結(jié)論:漢黃芩素具有增強(qiáng)Teff細(xì)胞功能、抑

8、制Treg細(xì)胞功能的活性，腹腔注射50 mg/kg、100 mg/kg漢黃芩素均可加劇DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎的發(fā)病，在劑量為100 mg/kg時(shí)作用更為顯著，間接證明漢黃芩素具有免疫增強(qiáng)活性。
　　2.漢黃芩素調(diào)節(jié)Teff/Treg細(xì)胞活性的分子機(jī)制
　　目的:探討漢黃芩素調(diào)節(jié)Teff/Treg細(xì)胞活性的分子機(jī)制。
　　方法:磁珠分選CD4+T細(xì)胞，加入IL-2和不同濃度漢黃芩素(50μg/ml、100μg/ml)刺激24

9、小時(shí)，提取細(xì)胞全蛋白。磁珠分選CD4+CD25-T細(xì)胞，加入anti-CD3、anti-CD28、TGF-β和IL-2體外誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，至第6天加入不同濃度漢黃芩素(50μg/ml、100μg/ml)刺激24小時(shí)，提取細(xì)胞全蛋白。Western blot分別檢測(cè)Teff/Treg細(xì)胞STAT3及磷酸化STAT3(Tyr705、Ser727)、NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65

10、、Erk及磷酸化Erk蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:漢黃芩素處理后的Teff細(xì)胞與對(duì)照組相比，p-NF-κB p65的表達(dá)水平顯著上調(diào);漢黃芩素處理組p-p44/42(Erk1/2)的表達(dá)升高，在劑量為50μg/ml時(shí)最為顯著;與對(duì)照組相比，100μg/ml漢黃芩素可下調(diào)STAT3總蛋白及p-STAT3(Y705)蛋白的表達(dá)，不同劑量漢黃芩素均可下調(diào)p-STAT3(S727)的表達(dá)，且呈劑量依賴性。漢黃芩素處理后的Treg細(xì)胞較對(duì)照

11、組p-NF-κB p65的表達(dá)水平上調(diào);漢黃芩素100μg/ml可抑制p44/42(Erk1/2)的磷酸化，而50μg/ml漢黃芩素與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異;100μg/ml漢黃芩素顯著下調(diào)STAT3總蛋白及p-STAT3(Y705)的表達(dá)，而不同劑量漢黃芩素則促進(jìn)STAT3-S727的磷酸化。
　　結(jié)論:漢黃芩素可能通過激活NF-κB、Erk信號(hào)通路，下調(diào)STAT3的表達(dá)及其磷酸化水平促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的活化;漢黃芩素可上調(diào)p-N