缺氧誘導(dǎo)胃癌調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化及黃芩素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、缺氧誘導(dǎo)胃癌調(diào)1I性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化及漢黃芩素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究蘭缺氧誘導(dǎo)胃癌調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化及漢黃芩素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatoryTcell，Treg)是一類(lèi)具有免疫抑制作用的淋巴細(xì)胞亞群，占丁F常人外周血中CD4T淋巴細(xì)胞亞群的5—10％。研究資料顯示，包括胃癌在內(nèi)多種腫瘤患者的外周|IⅡ及腫瘤組織中Treg細(xì)胞增多，其水平高低與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。Treg細(xì)胞可以抑制包括CD4T、CD8T、NK、NKT等

2、多種免疫細(xì)胞的腫瘤殺傷效應(yīng)，是介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素，也是腫瘤免疫治療的主要障礙之一。缺氧為實(shí)體腫瘤的普遍特彳i：F，可以通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵的分子通路影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可阻斷缺氧相關(guān)的分子通路，并可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，從而發(fā)揮抗腫瘤活性。結(jié)合以往研究，我們提出科研假說(shuō)：“缺氧促進(jìn)胃癌細(xì)胞分泌TGF131，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸”。為了驗(yàn)證此假說(shuō)，首先，利用胃癌手術(shù)標(biāo)本，探索胃癌組織中HIF—la

3、表達(dá)與Treg細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)性；其次，利用胃癌患者外周血標(biāo)本，分析手術(shù)前后TGF一131及Treg細(xì)胞的變化；然后，基于體外細(xì)胞試驗(yàn)，分析缺氧對(duì)胃癌細(xì)胞分泌TGF一131的影響，及其誘導(dǎo)生成Treg細(xì)胞的能力；最后，基于體外細(xì)胞試驗(yàn)，初步探索漢黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞分泌TGF一131及誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的影響。從l臨床角度而言，相關(guān)問(wèn)題的探討有助于對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，有望為腫瘤免疫治療提供新的靶點(diǎn)，并有助于闡明漢黃芩素抗腫瘤活性的機(jī)制

4、。研究?jī)?nèi)容分為4部分：1胃癌組織中Foxp3及HIFIz表達(dá)的關(guān)聯(lián)性及其與臨床病理特征的關(guān)系目的：分析胃癌患者腫瘤組織中Foxp3及HIF—let表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，探索兩者與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，并明確其對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)作用。方法：免疫組化法檢測(cè)99例胃痛患者的手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本中Foxp3及HIF—la表達(dá)，并分別進(jìn)行Foxp3Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)和HIFlet表達(dá)評(píng)分，并以免疫組化雙染檢測(cè)胃癌組織中Foxp3及HIF—let共表達(dá)情況結(jié)果：

5、胃癌組織中Foxp3在Treg細(xì)胞核中染色，HIFlet主要著色于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)及部分細(xì)胞漿內(nèi)，偶見(jiàn)于腫瘤組內(nèi)淋巴細(xì)胞著色。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：胃癌組織中Foxp3Treg缺氧誘導(dǎo)胃癌調(diào)1，性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化及、7義黃岑素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究!recombinantTGF—pl及各種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)磁珠分選的CD4CD25‘T細(xì)胞72小時(shí)，流式檢測(cè)Foxp3Treg細(xì)胞的比例。結(jié)果：趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Normoxic組較Control組Foxp3Treg細(xì)

6、胞的比例明顯提高，而Hypoxic組較Norrnoxic組Treg細(xì)胞的比例沒(méi)有顯著性差異。／、t1：培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Normoxic組及Hypoxic組Treg細(xì)胞的比例均較Control組明顯提高，Hypoxic組與Normoxic組比較，Treg細(xì)胞的比例也有顯著性升高。將胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823分別在缺氧及常氧條件下培養(yǎng)，以RTPCR、ELISA及免疫熒光方法檢測(cè)TGF—pl表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二種胃癌細(xì)胞的Hypoxic組均較N

7、ormoxic組胃癌細(xì)胞TGF—pl表達(dá)水平升高。以AGS的細(xì)胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基，用以培養(yǎng)磁珠分選得來(lái)的CD4CD25’T細(xì)胞72h，流式檢測(cè)Treg細(xì)胞比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Normoxic組及Hypoxic組中Treg細(xì)胞的比例均較Control組明顯提高，Hypoxic組較Normoxic組Treg細(xì)胞比例升高更為明顯，而應(yīng)用TGF—pl受體阻滯劑可部分阻斷這種誘導(dǎo)作用。結(jié)論：胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)Treg細(xì)胞有擴(kuò)增作用及趨化作用。缺氧

8、可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，而對(duì)其趨化能力無(wú)明顯影響。缺氧可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞高表達(dá)TGFD1，后者是誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的關(guān)鍵因子。4漢黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞分泌TGF—pl及誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的影響目的：體外觀察漢黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞分泌TGF—pl的影響，明確漢黃芩素是否可抑制幼稚T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。方法：分別在缺氧及常氧條件下培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823，并在其培養(yǎng)體系中加入漢黃芩素，以ELISA法檢測(cè)胃癌細(xì)胞培

9、養(yǎng)上清中TGFpa的濃度。以胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清制備條件培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)磁珠分選的CD4CD25一T細(xì)胞72小時(shí)，流式檢測(cè)Foxp3Treg細(xì)胞的比例。結(jié)果：常氧條件下漢黃芩素對(duì)AGS細(xì)胞分泌TGF131無(wú)明顯抑制作用，而對(duì)BGC823細(xì)胞分泌TGFpl有抑制作用，缺氧條件下漢黃芩素對(duì)AGS細(xì)胞和BGC823分泌TGF—pl均有抑制作用。以常氧培養(yǎng)的AGS細(xì)胞培養(yǎng)上清為條件培養(yǎng)基，漢黃芩素組與溶媒組CD4Foxp3T細(xì)胞比例無(wú)明顯差異：以缺