柱型蘋(píng)果MdCoL基因表達(dá)特性分析及功能驗(yàn)證.pdf

1、柱型蘋(píng)果（Columnar apple）樹(shù)體矮生，節(jié)間短，長(zhǎng)分枝少，是蘋(píng)果育種的珍貴資源。挖掘柱型Co基因以及探索其調(diào)控機(jī)理，對(duì)揭示柱型蘋(píng)果柱型性狀的形成及選育柱型蘋(píng)果新品種具有重要意義。
　　通過(guò)精細(xì)做圖已經(jīng)將Co基因定位在基因組的第10條染色體上，克隆得到了部分柱型相關(guān)基因，但是柱型Co基因及其如何調(diào)控柱型形成機(jī)理仍不清楚。本文以‘Wijcik’嫩莖為材料，克隆得到柱型候選基因，命名為MdCoL，采用Real-time PCR

2、技術(shù)檢測(cè)MdCoL基因在4組柱型蘋(píng)果材料（21-C、30-C、77-C、Wi）和普通型蘋(píng)果（21-S、30-S、77-S、Mc）中不同時(shí)期芽的相對(duì)表達(dá)量；通過(guò)轉(zhuǎn)化‘本生’煙草，驗(yàn)證MdCoL基因的功能；以4組柱型蘋(píng)果突變體為試材，對(duì)其葉片解剖結(jié)構(gòu)及光合特性的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了觀察和測(cè)定，以比較柱型蘋(píng)果和普通型蘋(píng)果的差別。研究結(jié)果如下：
　　1、以‘Wijcik’嫩莖為材料，克隆得到柱型候選基因，命名為 MdCoL，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為10

3、32bp，推測(cè)的蛋白質(zhì)的分子量為38.34kD，編碼339個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)（pI）為6.27。對(duì)柱型蘋(píng)果MdCoL蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)，MdCoL蛋白包含111個(gè)α-螺旋，占32.74％；135個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，占39.82%；73個(gè)延伸鏈，占21.53%。經(jīng)過(guò)氨基酸親水性分析表明，該蛋白的多數(shù)氨基酸為親水性氨基酸。
　　2、利用Real-time PCR分析了MdCoL基因在4組柱型蘋(píng)果及普通型蘋(píng)果的不同器官及不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)

4、表達(dá)量，結(jié)果表明：MdCoL基因在柱型蘋(píng)果中的芽和新梢中的表達(dá)量都明顯高于普通型蘋(píng)果中的表達(dá)量，且在新梢中的表達(dá)量都明顯低于在芽的表達(dá)量，此外，除30-C和30-S外，MdCoL在5月份芽的表達(dá)量高于另外兩個(gè)時(shí)期的芽。
　　3、將構(gòu)建好的pCAMBIA1300-MdCoL表達(dá)載體和pCAMBIA1300空載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入‘本生’煙草，經(jīng)PCR檢測(cè)，獲得17株陽(yáng)性鑒定的煙草植株。利用洋蔥表皮，瞬時(shí)表達(dá) pCAM

5、BIA1300-MdCoL，觀察到 MdCoL基因定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。
　　4、以未轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行株高、節(jié)間、莖粗度、開(kāi)花數(shù)、分枝數(shù)、葉綠素等生理指標(biāo)測(cè)定及表型觀察。結(jié)果表明：未轉(zhuǎn)基因煙草在株高、節(jié)間上是轉(zhuǎn)基因煙草的2-3倍，差異顯著；轉(zhuǎn)基因煙草根系粗壯、較長(zhǎng)且分支多，植株葉片濃綠且厚，節(jié)間短小，植株整體表現(xiàn)矮小、緊湊；未轉(zhuǎn)基因煙草根系短且分支少，葉片薄，節(jié)間長(zhǎng)，植株整體表現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)；轉(zhuǎn)基因煙草在花的數(shù)量上和葉

6、綠素（SPAD）濃度是明顯高于對(duì)照煙草，對(duì)照組煙草分枝數(shù)略多于轉(zhuǎn)基因煙草。轉(zhuǎn)基因煙草與柱型蘋(píng)果“樹(shù)體矮生，長(zhǎng)分枝少，節(jié)間短”的特性表現(xiàn)一致。
　　5、對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的赤霉素生物合成途徑、受體和DELLA蛋白相關(guān)基因的表達(dá)分析，結(jié)果表明：MdCoL基因上調(diào)了DELLA蛋白相關(guān)基因，從而抑制赤霉素反應(yīng)。
　　6、以四組柱型蘋(píng)果突變體為試材，對(duì)其葉片解剖結(jié)構(gòu)及光合特性的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了觀察和測(cè)定，結(jié)果表明:四組材料中，每組的柱型蘋(píng)果葉

7、片顏色濃綠，葉片較大、其重量、厚度、葉綠素（SPAD）含量、柵欄組織厚度和柵海比均顯著大于普通型蘋(píng)果。普通型蘋(píng)果葉片中每層?xùn)艡诮M織細(xì)胞大小一致，且排列整齊緊密，而柱型蘋(píng)果柵欄組織細(xì)胞排列相對(duì)雜亂。在一天的光合日變化中，柱型和普通型蘋(píng)果的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）均高于普通型蘋(píng)果，二者均呈明顯的雙峰曲線，12:00出現(xiàn)明顯的光合午休現(xiàn)象。在固定 LED光源下，同組材料中柱型蘋(píng)果凈光合速率（Pn）高于普通型，分別是普通型的1.1-