慢性丙型肝炎干擾素聯(lián)合利巴韋林治療優(yōu)化方案及Th17細(xì)胞免疫調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有1.85億HCV感染者，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例，HCV相關(guān)死亡35萬例，占所有傳染病死因的第5位。我國報告的HCV感染率逐年上升，2013年報告病例數(shù)超過22萬人。急性HCV感染后55％～85％慢性化，進(jìn)一步進(jìn)展為肝硬化，甚或并發(fā)肝細(xì)胞癌。因此，及時、有效的治療是阻止該病進(jìn)展，改善患者生活質(zhì)量的重要措施。

2、r>　　近年來，歐美國家已成功研發(fā)多種直接抗病毒藥物(directing antiviralagents，DAAs)，并經(jīng)臨床應(yīng)用獲得滿意效果。但由于DAAs價格昂貴，長期效果有待隨訪研究，我國目前仍以干擾素(interferon，IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin，RBV)為常規(guī)治療方案。研究證實，完成足量、全程治療人群持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率(sustained virological response，SVR)達(dá)78％～93.5％，

3、但由于上述藥物不良反應(yīng)較多，部分患者難以耐受，因此，優(yōu)化及個體化的治療方案可提高依從性，提高SVR率，改善預(yù)后。
　　宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫狀態(tài)與HCV感染的預(yù)后及抗病毒治療應(yīng)答密切相關(guān)，尤其HCV特異細(xì)胞免疫低下，可能為HCV感染慢性化的重要因素。輔助性T細(xì)胞17(T-helper17，Th17)，以分泌白細(xì)胞介素17（Interleukin-17，IL-17）作為其主要的效應(yīng)因子，在多種免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。I

4、L-23作為Th17細(xì)胞的上游因子，其調(diào)節(jié)與Th17細(xì)胞的增殖與激活有關(guān)。有文獻(xiàn)報道，IL-23參與慢性肝病的免疫及炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于慢性HCV感染過程中，IL-23調(diào)節(jié)對Th17細(xì)胞及其相關(guān)抗病毒分子表達(dá)的影響尚不十分清楚。因此，通過HCV感染患者血漿IL-23水平檢測、外周血Th17細(xì)胞功能研究以及IL-23/IL-17軸調(diào)節(jié)與抗病毒治療應(yīng)答關(guān)系的研究，將有助于慢性HCV感染抗病毒治療策略的優(yōu)化及預(yù)后的判斷。
　　第一

5、部分慢性丙型肝炎優(yōu)化治療方案的研究
　　目的:篩選適于我國不同慢性HCV感染人群的抗病毒治療方案，以改善患者依從性、提高治愈率。
　　方法:采用前瞻、開放性臨床研究，選擇2010年1月至2015年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院、邢臺市人民醫(yī)院、邯鄲市傳染病醫(yī)院、白求恩國際和平醫(yī)院、滄州市傳染病醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院、石家莊市第五醫(yī)院、圍場縣醫(yī)院住院慢性HCV感染者652例。根據(jù)患者年齡(＜65歲或≥65歲)、體重（＜60kg

6、或≥60kg）、合并疾病狀態(tài)（是否有肝硬化、糖尿病、心臟疾病、甲狀腺疾病等）及患者經(jīng)濟(jì)承受能力選擇不同治療方案:標(biāo)準(zhǔn)劑量組分別采用IFNα-2b500MIU，皮下注射，隔日一次或聚乙二醇干擾素(pegylated interferon，PegIFN)α-2a180μg、PegIFNα-2b80μg，皮下注射，每周一次，均聯(lián)合應(yīng)用RBV1200mg/d;小劑量組為IFNα-2b100MIU～300MIU，皮下注射，隔日一次或PegIFNα

7、-2a67.5～135μg、PegIFNα-2b50μg，皮下注射，每周一次，均聯(lián)合應(yīng)用RBV900mg/d。根據(jù)病毒學(xué)應(yīng)答出現(xiàn)時間制定總療程，即HCV RNA低于檢測下限，繼續(xù)治療44周，隨訪24周。并在治療前及治療期間監(jiān)測血常規(guī)、血清生化、糖耐量試驗、HCV RNA載量、血沉、風(fēng)濕三項、肝病自身抗體、甲狀腺功能、T淋巴細(xì)胞亞群、肝纖維化四項及甲胎蛋白，并行腹部超聲檢查。對比分析不同治療方案病毒學(xué)應(yīng)答率，包括快速病毒學(xué)應(yīng)答(rapid

8、virological respons，RVR)、完全早期病毒學(xué)應(yīng)答(complete early virologicalresponse，cEVR)和持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR);相關(guān)因素，包括宿主因素、病毒因素（病毒載量、基因型）、治療應(yīng)答時間;不良反應(yīng)發(fā)生情況，包括流感樣癥候群、一過性骨髓抑制、甲狀腺功能異常、精神異常、皮疹等。
　　結(jié)果:
　　1患者一般情況6

9、52例患者中，482例(73.93％)為輸血及血制品感染，手術(shù)/外傷感染73例(11.20％)，其他97例(14.87％)。364例患者HCV基因型檢測顯示，1b型260例(71.43％)，2a型76例(20.88％)。240例采用IFNα-2b治療，其中小劑量109例，男50例，女59例，平均年齡49.56±12.45歲，平均體質(zhì)量指數(shù)(Body mass index，BMI)23.57±3.32kg/m2;標(biāo)準(zhǔn)劑量組131例，男53

10、例，女78例，平均年齡45.92±10.23歲，平均BMI為24.14±3.22kg/m2。PegIFNα-2a治療組357例，其中小劑量組92例，男33例，女59例，平均年齡為50.83±13.41歲，平均BMI為23.72±3.46kg/m2;標(biāo)準(zhǔn)劑量組265例，男120例，女145例，平均年齡為46.73±11.36歲，平均BMI為23.69±3.04kg/m2。PegIFNα-2b治療組55例，其中小劑量組29例，男16例，女1

11、3例，平均年齡為51.19±13.70歲，平均BMI為22.83±2.78kg/m2;標(biāo)準(zhǔn)劑量組26例:男12例，女14例，平均年齡48.20±13.44歲，平均BMI為24.32±2.35kg/m2，各標(biāo)準(zhǔn)劑量與小劑量組相比，在性別、年齡、體重指數(shù)、治療前血清ALT水平、HCV RNA載量以及HCV基因型構(gòu)成等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2治療應(yīng)答情況 IFNα-2b標(biāo)準(zhǔn)劑量組、小劑量組RVR、cEVR、SVR

12、率分別為64.12％、90.08％、80.68％和41.28％、68.81％、71.43％，標(biāo)準(zhǔn)劑量組RVR及cEVR率均明顯高于小劑量組（P均＜0.001），而SVR率兩組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。PegIFNα-2a標(biāo)準(zhǔn)劑量組和小劑量組RVR、cEVR、SVR率分別為74.34％、94.34％、88.84％和63.04％、83.70％、83.10％，標(biāo)準(zhǔn)劑量組RVR及cEVR率顯著高于小劑量組（分別為P＜0.05，P＜0.0

13、1）。PegIFNα-2b標(biāo)準(zhǔn)劑量組、小劑量組RVR、cEVR、SVR率分別為73.08％、100％、100％和34.48％、79.31％、64.71％，標(biāo)準(zhǔn)劑量組RVR、cEVR及SVR率均明顯高于小劑量組(分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)。不同類型干擾素組比較，IFNα-2b治療組RVR、cEVR、SVR率分別為53.75％、80.42％和76.82％，PegIFNα-2a治療組分別為71.43％、91.60％和87

14、.58％，PegIFNα-2b治療組分別為52.73％、89.09％和80.00％。三種類型干擾素相比，RVR、cEVR及SVR率均有明顯差異（分別為P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05）。兩兩比較，PegIFNα-2a治療組RVR率明顯高于IFNα-2b治療組及PegIFNα-2b治療組（分別為P＜0.001，P＜0.01），同時，PegIFNα-2a治療組cEVR及SVR率均明顯高于IFNα-2b治療組（分別為P＜0.001

15、，P＜0.05）。發(fā)生代償期肝硬化患者(n=38)和非肝硬化患者(n=614) RVR、cEVR、SVR率分別為34.21％、57.89％、66.67％和65.15％、89.09％、84.87％，非肝硬化患者RVR、cEVR、SVR率均顯著高于發(fā)生代償期肝硬化患者(分別為P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05)。HCV基因1型感染者(n=282)和非HCV基因1型感染者(n=82) RVR、cEVR、SVR率分別為56.38％、8

16、4.75％、81.40％和79.27％、92.68％、85.94％，非HCV基因1型感染者RVR率顯著高于HCV基因1型感染者(P＜0.001)。具體到不同的干擾素治療組，IFNα-2b治療組基因1型感染患者(n=94)和非HCV基因1型感染患者(n=33)獲得RVR、cEVR及SVR率分別為43.62％、72.34％、70.91％和72.73％、93.94％、86.36％，非HCV基因1型患者RVR及cEVR率均明顯高于基因1型感染患

17、者（分別為P＜0.01，P＜0.05）。PegIFNα-2a治療組基因1型感染患者(n=163)和非HCV基因1型感染患者(n=39)獲得RVR、cEVR及SVR率分別為65.64％、92.02％、86.99％和87.18％、92.31％、86.49％，非HCV基因1型患者RVR率明顯高于基因1型患者(P＜0.01)。而PegIFNα-2b治療組基因1型感染患者(n=25)和非HCV基因1型感染患者(n=10)獲得RVR、cEVR、SV

18、R率分別為44.00％、84.00％、64.29％和70.00％、90.00％、80.00％，基因1型患者與非基因1型患者相比RVR、cEVR及SVR率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3不良反應(yīng)發(fā)生情況 IFNα-2b、PegIFNα-2a和PegIFNα-2b不良反應(yīng)發(fā)生率分別為5.42％、9.24％和3.64％;代償期肝硬化和非肝硬化患者分別為2.63％和6.65％;基因1型感染患者和非基因1型感染患者分別為5.03％和

19、7.41％;小劑量組和標(biāo)準(zhǔn)劑量組不良反應(yīng)發(fā)生率分別為IFNα-2b7.34％和3.82％, PegIFNα-2a12.12％和5.66％, PegIFNα-2b3.45％和3.85％,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:根據(jù)患者年齡、體重、合并疾病及家庭經(jīng)濟(jì)承受力等情況優(yōu)化抗HCV治療方案，并依據(jù)治療早期病毒學(xué)應(yīng)答情況調(diào)整療程，可顯著改善耐受性、依從性，提高SVR率，改善預(yù)后。
　　第二部分 Th17細(xì)胞在慢性H

20、CV感染中的作用及其與IFN/pegIFN+RBV治療應(yīng)答的關(guān)系
　　目的:探明慢性HCV感染者Th17細(xì)胞亞群及其表達(dá)免疫相關(guān)因子水平變化、與抗病毒治療應(yīng)答的相關(guān)性，為抗HCV治療效果提供新型預(yù)測標(biāo)志。
　　方法:選擇慢性HCV感染者66例，包括IFNα-2b/RBV13例、PegIFNα-2a/RBV53例，療程為48～72周。另選性別、年齡匹配的20例健康體檢者作為對照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測健康對照及慢性HCV感染者在

21、抗病毒治療前、治療12、24、48周外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中表達(dá)IL-17A、IFN-γ、IL-21細(xì)胞亞群的比率，分析其與病毒學(xué)應(yīng)答的關(guān)系。
　　結(jié)果:慢性HCV感染者表達(dá)IL-17A+PBMCs（中位數(shù)為4.16％）、表達(dá)IFN-γ+PBMCs(8.17％)比率均顯著高于健康對照組(分別為1.18％和1.38％)，而表達(dá)IL-21+ PBMCs(2.

22、15％)比率顯著低于健康對照組(4.51％)，P均＜0.001。IFNα-2b/RBV或PegIFNα-2a/RBV治療后，54.5％(39/66)獲得RVR，89.4％(59/66)獲得cEVR。治療12周時，表達(dá)IL-17A+PBMCs(1.00％)和表達(dá)IFN-γ+PBMCs(3.26％)比率較基線水平顯著降低（分別為P＜0.001，P＜0.01）。治療24和48周時，表達(dá)IL-17A+PBMCs比率與12周相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（

23、分別為1.57％和0.90％，P＞0.05）;而表達(dá)IFN-γ+PBMCs比率在治療24周時(1.83％)較12周輕微降低(P＞0.05)，在48周時(1.51％)與12周相比明顯降低(P＜0.001)。表達(dá)IL-21+PBMCs比率在治療12周時(4.01％)較基線水平顯著升高(P＜0.05);在治療24周時(1.91％)較12周明顯下降(P＜0.001)，恢復(fù)至基線水平;而治療48周時(1.44％)與基線水平相比明顯降低(P＜0.0

24、5)。同時，獲得RVR的患者基線表達(dá)IL-21+PBMCs比率明顯高于未獲得者（分別為2.18％和1.88％，P＜0.05）。
　　結(jié)論:干擾素聯(lián)合利巴韋林治療可通過下調(diào)表達(dá)IL-17A+及IFN-γ+PBMCs比率和上調(diào)表達(dá)IL-21+PBMCs比率發(fā)揮協(xié)同抗病毒作用，提高病毒學(xué)應(yīng)答率。
　　第三部分 IL-23調(diào)控對Th17細(xì)胞及抗病毒分子表達(dá)的作用
　　目的:明確慢性HCV感染患者血漿IL-23水平的變化，并進(jìn)一

25、步觀察IL-23調(diào)控對Th17細(xì)胞活性的影響，為慢性HCV感染靶向性免疫治療策略的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:選擇慢性HCV感染者55例，年齡、性別匹配的健康對照20例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿IL-23水平。其中留取24例慢性HCV感染者和15例健康對照外周血，依據(jù)密度梯度離心法分離PBMCs，分為3組進(jìn)行體外培養(yǎng):空白組:不予任何干預(yù);IL-2

26、3激動劑組:加入人IL-23重組蛋白;IL-23拮抗劑組:加入抗人IL-23 P19功能等級純化蛋白。上述細(xì)胞在37℃、5％CO2的條件下共培養(yǎng)48h，分離細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測空白組IL-23表達(dá)水平;各組PBMCs均采用實時熒光定量PCR檢測IL-17A、IL-21、IL-22、IFN-γ、兩面神激酶(janus kinase1，JAK1)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activa

27、tor of transcription1,STAT1)、STAT3、干擾素調(diào)節(jié)因子9（Interferon regulatory factor9，IRF9）、粘病毒抗性蛋白A（myxovirus resistance protein A，MxA）、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白3(suppressor of cytokine3，SOCS3)、表達(dá)于T淋巴細(xì)胞上的T盒(T-boxexpressed in T cells，T-bet)、GATA

28、結(jié)合蛋白3(GATA binding protein3，GATA3)、叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box P3，F(xiàn)oxP3）mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:慢性HCV感染者血漿（中位數(shù)為107.17 pg/ml）及PBMCs培養(yǎng)上清IL-23水平（23.18 pg/ml）均顯著高于健康對照組（分別為69.03pg/ml和6.06 pg/ml），P值分別為＜0.05和＜0.001;治療后獲得RVR的患者基線血漿IL-23水

29、平(103.65 pg/ml)與未獲得者（121.07 pg/ml）相比無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。HCV患者空白組、IL-23激動劑組和IL-23拮抗劑組PBMCs表達(dá)IL-17A（分別為P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）、IL-22（分別為P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01）、IFN-γ(分別為P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)和GATA3（分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）mRNA水平均顯著

30、高于健康對照各組。IL-21(P均＜0.05)和STAT3(P均＜0.001)mRNA增高見于IL-23激動劑和拮抗劑組;負(fù)反饋抑制因子SOCS3 mRNA增高見于空白組和IL-23激動劑組（分別為P＜0.01，P＜0.05）;轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 mRNA則于空白組和IL-23拮抗劑組顯著增高(分別為P＜0.05，P＜0.001);通路因子STAT1、抗病毒蛋白MxA mRNA增高僅見于空白組（分別為P＜0.01，P＜0.001）;而轉(zhuǎn)

31、錄因子T-bet和通路因子JAK1、IRF9 mRNA水平三組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。健康對照各處理組間比較顯示，PBMCs表達(dá)MxA和SOCS3 mRNA水平在IL-23激動劑組明顯增高（P均＜0.01）。JAK1、STAT3、IRF9、IL-22和IFN-γ mRNA表達(dá)水平在IL-23拮抗劑組顯著下降（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。STAT1mRNA表達(dá)水平在IL-23激動劑

32、組顯著增高(P＜0.01)，而在IL-23拮抗劑組明顯降低(P＜0.01)。FoxP3 mRNA表達(dá)水平在IL-23拮抗劑組較IL-23激動劑組顯著增高(P＜0.01)。而IL-17A、IL-21、T-bet和GATA3三組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。HCV感染者組間比較顯示，PBMCs表達(dá)IL-21和IFN-γ mRNA水平在IL-23激動劑組顯著增高（分別為P＜0.01，P＜0.05）。IL-22、STAT1和IRF9 mR

33、NA表達(dá)水平在IL-23拮抗劑組明顯降低（分別為P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01）。STAT3、MxA、SOCS3 mRNA表達(dá)水平在IL-23激動劑組明顯升高（分別為P＜0.001，P＜0.01，P＜0.01），在IL-23拮抗劑組明顯下降（分別為P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。而FoxP3 mRNA表達(dá)水平在IL-23激動劑組較空白組輕微降低(P＞0.05)，相反，在IL-23拮抗劑組明顯增高(P＜0.01)。

34、IL-17A、JAK1、GATA3和T-bet mRNA表達(dá)水平三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:HCV感染患者血漿及PBMCs表達(dá)IL-23水平顯著增高;IL-23調(diào)節(jié)可增強(qiáng)表達(dá)Th17的PBMCs活性，上調(diào)IL-17A、IL-21、IL-22、IFN-γ等免疫因子及抗病毒蛋白MxA表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)錄因子FoxP3及GATA3表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)抗HCV免疫反應(yīng)，提示IL-23及其下游Th17細(xì)胞可能為慢性HCV感染治療的重