油菜自交不親和基因BnSCR1和BnSRK1保守性及其啟動子調(diào)控分析.pdf

1、自交不親和性是開花植物抑制自交、促進異交的自然現(xiàn)象，是雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。已有研究表明，花粉端SP11/SCR(S-locus protein11or S-locus Cys-rich protein)與柱頭端SRK(S-locus receptor kinase)相互識別及SRK下游信號傳導導致甘藍型油菜自交不親和性。本文研究蕓薹屬BnSCR1-BnSRK1-BnARC1自交不親和信號通路在擬南芥中的保守性，自交不親和系“W-3”

2、的BnSCR1基因和BnSRK1基因啟動子順式作用元件及反式調(diào)控因子，為進一步揭示甘藍型油菜自交不親和機理、蕓薹屬自交不親和信號路徑奠定基礎。主要結(jié)果如下。
　　1.構(gòu)建pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1和pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1+BnARC1兩種過表達載體，分別導入Col-0和C24兩種生態(tài)型擬南芥，獲得Col-0和C24過表達BnSCR1+BnSRK1轉(zhuǎn)基因植株21株和13株，Col-0和C24過表達

3、BnSCR1+BnSRK1+BnARC1轉(zhuǎn)基因植株12株和9株。通過授粉試驗觀察、角果長度和每角果粒數(shù)考察及外源基因表達檢測，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)基因植株自交親和，說明在擬南芥Col-0和C24中，蕓薹屬自交不親和信號通路BnSCR1-BnSRK1-BnARC1不起作用。
　　2.克隆了BnSRK1基因2kb啟動子序列;啟動子分析表明，PR1-GUS（-1809～-1bp）和PR2-GUS（-1314～-1bp）能夠驅(qū)動GUS基因在柱頭中表

4、達;啟動子缺失分析結(jié)果表明，調(diào)控BnSRK1基因表達的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域位于-1314～1000bp?？寺×刷蝾怱單倍型的BnSCR-1300基因翻譯起始位點上游504bp啟動子和BnSCR-6基因翻譯起始位點上游416bp啟動子，啟動子分析表明60P-GUS(-504～-1bp)和15P-GUS(-416～-1bp)均能驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥花藥發(fā)育的第9期至11期的絨氈層表達。
　　3.通過酵母單雜交實驗獲得了與BnSCR1基

5、因684bp啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子BnPHL2α。兩輪誘餌序列截短實驗表明BnPHL2α與p16X-3-AbAi的16bp(TTTAATTTCTTGCATA)序列互作。亞細胞定位結(jié)果表明BnPHL2α定位在細胞核中。利用AH109酵母菌株沒有檢測到BnPHL2α的轉(zhuǎn)錄活性;通過BnPHL2α轉(zhuǎn)錄激活/抑制結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)BnPHL2α存在兩個保守區(qū)域（位于136-185aa的MYB CC結(jié)構(gòu)域、37-90aa的MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）可能

6、是該蛋白的抑制區(qū)域。雙熒光素酶報告(Dual luciferase reporter，DLR)系統(tǒng)檢測BnPHL2α基因?qū)nSCR1啟動子P342活性表明，BnPHL2α基因抑制P342啟動子的活性;P342啟動子區(qū)域（-310至-295bp）序列(TTTAATTTCTTGCATA)的一系列突變實驗表明，BnPHL2α對BnSCR1啟動子P342活性調(diào)控的抑制位點位于-310至-295bp區(qū)域。EMSA實驗驗證，BnPHL2α蛋白能夠