UCHL1對TrkB的去泛素化調(diào)節(jié)及其在學(xué)習(xí)記憶中的作用.pdf

1、目的和背景:
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF通過受體酪氨酸激酶B(TrkB)在調(diào)控神經(jīng)元存活、生長發(fā)育、突觸可塑性等方面發(fā)揮重要作用[1]，而TrkB的翻譯后修飾直接影響其生物學(xué)功能的發(fā)揮。已知TrkB可被泛素化[2]，但是其調(diào)控分子和功能尚不清楚。
　　UCHL1屬泛素羧基水解酶家族，在腦中含量豐富，已有報(bào)道UCHL1參與神經(jīng)元突觸可塑性的調(diào)控[3]。我們前期質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)UCHL1可與TrkB結(jié)合，提示UCHL1可能參與調(diào)

2、控TrkB。本課題主要對UCHL1是否調(diào)控TrkB去泛素化及其生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究。
　　方法:
　　為研究UCHL1對TrkB去泛素化調(diào)節(jié)及對其生物學(xué)功能的影響，我們通過構(gòu)建UCHL1或TrkB相關(guān)質(zhì)粒，免疫共沉淀分析UCHL1與TrkB的相互作用及UCHL1對TrkB泛素化的調(diào)節(jié)。通過免疫熒光定量分析、膜表面可裂解生物素檢測TrkB受體分布及內(nèi)吞和再循環(huán)等實(shí)驗(yàn)，分析UCHL1對TrkB去泛素化調(diào)控對TrkB內(nèi)吞、再循環(huán)

3、的影響。我們還通過contextual fear conditioning(CFC)、曠場(open field)分析UCHL1對TrkB去泛素化調(diào)控在小鼠學(xué)習(xí)記憶和運(yùn)動(dòng)能力中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.TrkB與UCHL1有相互作用
　　免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(co-immunoprecipiTATion，CO-IP)證明TrkB-FL與T1均可與UCHL1相互作用。進(jìn)一步利用Co-IP，發(fā)現(xiàn)TrkB中JM1區(qū)和UCHL1

4、中75-85氨基酸是兩者結(jié)合的必要和充分條件。
　　2.UCHL1調(diào)控TrkB的去泛素化過程
　　通過P4D1及FK1抗體檢測，我們發(fā)現(xiàn)TrkB主要為多個(gè)位點(diǎn)單泛素化。通過過表達(dá)、干擾UCHL1以及體外去泛素化檢測等驗(yàn)證UCHL1可調(diào)節(jié)TrkB的去泛素化，并且主要調(diào)控488位點(diǎn)的去泛素化。
　　3.UCHL1參與調(diào)控膜表面TrkB內(nèi)吞以及內(nèi)吞之后的轉(zhuǎn)運(yùn)過程
　　TAT-UCHL175-85多肽可通過抑制UCHL1

5、與TrkB-FL的結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)BDNF誘導(dǎo)的TrkB泛素化，進(jìn)而促進(jìn)膜表面TrkB的內(nèi)吞，而內(nèi)吞之后的再循環(huán)TrkB減少，更多TrkB內(nèi)吞后降解，最終使得TrkB及其下游信號(hào)通路受到抑制。
　　4.TAT-UCHL175-85可通過抑制UCHL1與TrkB的結(jié)合降低C57小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力
　　通過CFC測試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射TAT-UCHL175-85小鼠CFC過程中獲得受損。
　　結(jié)論:
　　我們發(fā)現(xiàn)UCHL1