間充質(zhì)干細(xì)胞在原發(fā)性肝癌形成前和形成后的不同作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　近年來，腫瘤微環(huán)境對肝癌發(fā)生發(fā)展的作用越來越受到重視。腫瘤并不是簡單孤立的由癌細(xì)胞增殖形成;相反，是由多種不同類型細(xì)胞參與的，組成異質(zhì)性的交互復(fù)雜的組織。癌細(xì)胞可以招募正常細(xì)胞誘導(dǎo)其分化為腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞，共同構(gòu)成腫瘤微環(huán)境。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有對炎癥損傷和腫瘤的趨向性，是腫瘤微環(huán)境的一個重要組成部分。但其對腫瘤的作用尚未明確，有的文獻(xiàn)報道MSCs促進(jìn)腫

2、瘤發(fā)生發(fā)展，也有文獻(xiàn)報道MSCs抑制腫瘤，可以作為新興的抗癌藥物/基因傳遞的載體用于治療腫瘤。本課題通過研究MSCs在肝癌發(fā)生前后的作用及機(jī)制，為安全和有效應(yīng)用MSCs治療肝癌或者其它肝臟疾病提供有力證據(jù)支持。
　　本課題將從以下兩方面展開:第一部分探討間充質(zhì)干細(xì)胞在肝癌發(fā)生的不同階段對肝癌的影響;第二部分研究間充質(zhì)干細(xì)胞在肝癌發(fā)生不同階段起不同作用的機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分 探討間充質(zhì)干細(xì)胞在肝癌發(fā)生的不同階

3、段對肝癌的影響。
　　在這一部分，我們首先建立二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠原發(fā)性肝癌模型，連續(xù)觀察不同誘癌時間（0、4、8、12、16周）肝癌發(fā)生發(fā)展情況，并依此將DEN誘發(fā)肝癌的過程劃分肝癌形成前（Initial stage，Is）和形成后(Progressive stage，Ps)。然后分別在肝癌形成前和形成后給予MSCs，通過對各組大鼠生存時間、腫瘤發(fā)生率、最大腫瘤體積及腫瘤數(shù)量等進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，分析MSCs對肝癌發(fā)生發(fā)展的

4、影響。結(jié)果:1、DEN誘癌模型中，通過對各個時間點(diǎn)的肝臟結(jié)構(gòu)、質(zhì)地及H&E染色觀察劃分肝癌形成前為從誘癌0周到第9周，此時，肝臟仍無明顯腫瘤生成;而第9周到第17周則可以被歸為肝癌形成后。2、與同時間DEN誘癌組相比，在肝癌形成前給予MSCs腫瘤發(fā)生率、最大腫瘤體積及腫瘤數(shù)量明顯降低，生存期延長;而在肝癌形成后給予MSCs最大腫瘤體積及腫瘤數(shù)量則明顯增加，生存期縮短。
　　第二部分 研究間充質(zhì)干細(xì)胞在肝癌發(fā)生不同階段起不同作用的機(jī)

5、制。
　　為了探討MSCs在肝癌形成前抑制肝癌發(fā)生是否由于MSCs對肝臟損傷具有保護(hù)作用，我們分別檢測誘癌第8周時DEN組和DEN+MSCs(Is)組的大鼠肝功能(ALT、AST)和肝臟細(xì)胞凋亡(Tunel)情況，結(jié)果:DEN+MSCs(Is)組ALT和AST低于DEN組，且肝臟細(xì)胞凋亡明顯減少;另外，我們的研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠抑制DEN誘癌大鼠肝臟細(xì)胞ROS累積和DNA損傷。H&E染色發(fā)現(xiàn)，DEN+MSCs(Is)組匯管周圍募集

6、的淋巴細(xì)胞較少;且Bio-plex和Q-PCR檢測結(jié)果顯示，DEN+MSCs(Is)組肝臟組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6明顯低于DEN組。通過天狼星紅染色和α-SMA探針標(biāo)記發(fā)現(xiàn)DEN+MSCs(Is)組中肝星狀細(xì)胞激活減少，肝臟組織纖維化程度降低。
　　接下來我們探討MSCs在肝癌形成后促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，我們分別檢測誘癌第14周時DEN組和DEN+MSCs(Ps)組肝癌組織中細(xì)胞凋亡(Tunel

7、)和增殖（Ki67）情況，發(fā)現(xiàn)上述兩組細(xì)胞凋亡數(shù)目無顯著性差異，而DEN+MSCs(Ps)組中大鼠腫瘤細(xì)胞增殖數(shù)目明顯高于DEN組，呈增殖活躍狀態(tài);同時，我們發(fā)現(xiàn)DEN+MSCs(Ps)組肝癌組織中EpCAM和AFP表達(dá)增高，提示腫瘤干細(xì)胞比例增多;且較DEN組，DEN+MSCs(Ps)組Ecadherin表達(dá)明顯減少而Vimentin表達(dá)增高，提示MSCs可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在TNF-α/IFN-γ刺激下

8、，MSCs對肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT有明顯促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，結(jié)合兩部分研究結(jié)果，可以得出以下結(jié)論:
　　1、間充質(zhì)干細(xì)胞在肝癌發(fā)生的不同階段對肝癌作用不同，在肝癌形成前具有抑制腫瘤發(fā)生的作用，而在肝癌形成后則具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。
　　2、 MSCs在肝癌形成前抑制腫瘤發(fā)生可能是由于MSCs抑制肝臟細(xì)胞ROS累積和DNA損傷，并減弱炎癥效應(yīng)和抑制肝纖維化，最終抑制肝癌發(fā)生。而在肝癌形成