住院患者糞便中耐碳青霉烯G-桿菌調(diào)查及耐藥機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究調(diào)查了住院患者糞便中的耐碳青霉烯G-細菌攜帶率，對耐碳青霉烯G-細菌進行屬種鑒定和藥敏試驗，并對其耐藥機制進行研究，檢測了常見的碳青霉烯酶基因，ESBL基因，及常見的耐藥基因轉(zhuǎn)移元件:整合子和ISCR，并進一步對整合子和ISCR攜帶的耐藥基因盒進行檢測和分析，闡明耐碳青霉烯G-細菌的耐藥機制，為臨床更好的防治提供信息。因產(chǎn)NDM超級細菌之前已經(jīng)做了相關(guān)研究，本研究主要針對余下的非產(chǎn)NDM耐碳青霉烯G-細菌展開。<

2、br>　　方法：
　　1.標(biāo)本收集收集南方醫(yī)院2013年7月至12月之間住院患者糞便標(biāo)本5000份。在含2 mg/l美羅培南麥康凱平板上培養(yǎng)分離耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌。并進行分純、轉(zhuǎn)種和保存，用試劑盒提取細菌全基因組DNA。
　　2.菌株屬種鑒定及藥敏試驗利用BD phoenix100全自動微生物鑒定儀器對耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌進行屬種鑒定和MIC藥敏試驗。并同時用K-B紙片法法對亞胺培南和美羅培南的藥敏結(jié)果加以確認。<

3、br>　　3.16S rRNA基因測序利用標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床常見菌株建立16S rRNA基因序列分析方法，對細菌進行分子生物學(xué)鑒定。利用這一方法對南方醫(yī)院三年來的臨床難鑒定細菌進行鑒定，并進一步擴展到血培養(yǎng)標(biāo)本的應(yīng)用檢測。對糞便中分離的耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌擴增16S rRNA基因并測序，經(jīng)過序列分析進行其屬種的確認，并與BD phoenix100的鑒定結(jié)果進行比較。
　　4.常見碳青霉烯酶基因的檢測 PCR檢測糞便中分離的耐碳青霉

4、烯的革蘭陰性桿菌的常見碳青霉烯酶基因KPC、VIM、IMP、SPM、GES、SIM、GIM、OXA-48基因，對于不動桿菌加測OXA-23-1ike、OXA-24-1ike、OXA-51-like、OXA-58-1ike四群OXA類的碳青霉烯酶基因，將陽性PCR產(chǎn)物進行測序驗證并確定其亞型。
　　5.ESBL基因的檢測 PCR檢測糞便中分離的耐碳青霉烯的腸桿菌科細菌的常見ESBL基因TEM、SHV、CTX-M基因，將陽性PCR產(chǎn)物

5、進行測序驗證并確定其亞型。
　　6.Ⅰ類整合子及其基因盒檢測 PCR先擴增Ⅰ類整合子的保守區(qū)整合酶1基因，再對陽性菌株進一步擴增Ⅰ類整合子的可變區(qū)。根據(jù)限制性內(nèi)切酶HinfⅠ和RsaⅠ酶切可變區(qū)的圖譜對不同菌株的可變區(qū)初步分類，同一屬種不同的酶切譜型挑選2株進行可變區(qū)測序，分析序列的同源性得出各可變區(qū)的耐藥基因盒組合。
　　7.ISCR及其基因盒檢測先利用PCR擴增orf513基因，再對陽性菌株進一步擴增其攜帶的基因盒。根據(jù)

6、限制性內(nèi)切酶HinfⅠ和RsaⅠ酶切基因盒的圖譜對不同菌株的可變區(qū)初步分類，同一屬種不同的酶切譜型挑選2株進行可變區(qū)測序，分析序列的同源性得出各可變區(qū)的耐藥基因盒組合。
　　8.復(fù)雜性整合子檢測根據(jù)復(fù)雜性整合子的結(jié)構(gòu)特點，對于Ⅰ類整合子可變區(qū)和ISCR1可變區(qū)同時陽性的細菌，PCR擴增兩者的串聯(lián)保守區(qū)，再對陽性菌進一步設(shè)計引物檢測兩者的串聯(lián)可變區(qū)，再進一步對串聯(lián)可變區(qū)測序，分析序列的同源性得出復(fù)雜性整合子耐藥基因盒組合。
　

7、　結(jié)果：
　　1.耐碳青霉烯細菌的分離和屬種分布從5000份糞便標(biāo)本中共篩查到389株耐碳青霉烯G-桿菌，包括58株腸桿菌科細菌和331株非發(fā)酵G-菌（含60株嗜麥芽窄食單胞菌，271株其他非天然耐碳青霉烯非發(fā)酵菌），其中96株為NDM陽性菌株，其余293株細菌，包括36株腸桿菌科細菌和257株非發(fā)酵G-菌（含60株嗜麥芽窄食單胞菌，197株其他非天然耐碳青霉烯非發(fā)酵菌）。
　　2.細菌的藥敏結(jié)果BD phoenix100給

8、出了以下10種抗生素的MICs值，包括阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、粘菌素、復(fù)方新諾明、氯霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和四環(huán)素。根據(jù)CLSI文件M100-S23對細菌進行藥敏結(jié)果判斷，非發(fā)酵菌和腸桿菌科細菌這兩組細菌對于上述這些藥物的敏感率不同。非發(fā)酵菌的敏感率分別為88.24％、25.82％、0、0、100.00％、26.89％、X、16.23％、45.76％、35.44％;而腸桿菌科的敏感率為56.36％、8.76％、0、0

9、、X、4.12％、25.69％、17.58％、29.72％、22.34％（X表示CLSI沒有相應(yīng)的藥敏參考折點）。K-B法檢測的IPM和MEM與儀器法藥敏結(jié)果一致。
　　3.16S rRNA基因序列分析方法的應(yīng)用建立16S rRNA基因序列分析方法，用于220株難鑒定細菌的屬種鑒定，其測序結(jié)果共分為45個種屬，其中8株為第一次在中國報道，2株為第一次在國際報道。100例血培養(yǎng)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)10例16S rDNA和儀器法鑒定結(jié)果不一致，

10、233株糞便分離的耐碳青霉烯G-桿菌中，27例非發(fā)酵菌的16S rDNA和儀器法鑒定結(jié)果不一致，以16SrDNA鑒定結(jié)果為準(zhǔn)，其他結(jié)果均一致。
　　4.碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果在233株耐碳青霉烯G-桿菌中共檢出IMP基因陽性菌株41株，分3種亞型，IMP-1，IMP-4，IMP-9。VIM基因陽性菌株31株，全部為VIM-2型。并有菌株同時攜帶IMP和VIM基因。IMP和VIM基因陽性菌株主要分布與假單胞菌屬中，也可見于腸桿菌科和

11、部分非發(fā)酵菌。其余基因blaKPC、blaGIM、 blaSPM、blaSIM、bla GES、bla OXA-48均未檢出陽性菌株。26株不動桿菌的OXA基因檢測，20株含blaOXA-23、5株含blaOXA-24、19株含bla OXA-51、7株含blaOXA-58，同時有菌株同時攜帶多種OXA基因。
　　5.ESBL基因檢測結(jié)果36株耐碳青霉烯腸桿菌科細菌中，21株含blaTEM,16株含blaSHV，7株含blaCTX

12、-M，且有細菌同時攜帶兩種甚至三種ESBL基因。
　　6.Ⅰ類整合子及其基因盒檢測結(jié)果233株耐碳青霉烯細菌中Ⅰ類整合子陽性135株，其中97株可變區(qū)陽性菌株中共發(fā)現(xiàn)37種不同的基因盒排列組合。這37種基因盒組合中共包括40種不同的基因盒，分別是氨基糖苷類耐藥基因:aadA1，aadA2，aadA4,aadA5,aadA13,aadA24，aadB,aac(6')-Ⅱ,aacA4,aacA4-1ike，aacA6，aacA7;β-

13、內(nèi)酰胺酶耐藥基因:blaOXA-10，blaOXA-21，blaOXA-30，blaOXA-101，blaPSE-1，blaVIM-2，blaIMP-1，blaIMP-4，blaIMP-9;甲氧芐啶耐藥基因:dfrA1，dfrA5，dfrA12，dfrA14，dfrA15，dfrA17，dfrA25，dfrA27;氯霉素耐藥基因:cmlA1，cmlA8，catB2，catB8，catB-like;利福平耐藥基因arr-3。另外有四個基因

14、盒orfⅡ、orfⅢ、orfC、orfF尚未證實與耐藥基因有關(guān)。在本實驗的37種不同的基因盒組合中，有7種排列為在所有細菌屬種首次報道，2種在相應(yīng)細菌屬種中首次報道。在1株陰溝腸桿菌中檢測到blaIMP-4基因盒，在惡臭假單胞菌、無色桿菌和1株Cupriavidus pauculus中檢測到blaIMP-1基因盒，在銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌中檢測到blaVIM-2基因盒。
　　7.ISCR及其基因盒檢測結(jié)果233株耐碳青霉烯細菌

15、中ISCR1陽性93株，在41株可變區(qū)陽性菌株中共發(fā)現(xiàn)9種不同的基因盒排列組合，這9種基因盒組合中包括不同的基因盒，分別是是氨基糖苷類耐藥基因:aadA2，aacA6;β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因:blaPER-1，bla CTX-M-9;甲氧芐啶耐藥基因:dfrA10，dfrA12，dfrA16;喹諾酮耐藥基因:qnrA1，qnrB2，qnrB6;利福平耐藥基因arr-3。
　　8.復(fù)雜性整合子檢測結(jié)果Ⅰ類整合子和ISCR1串聯(lián)形成的復(fù)

16、雜性整合子共檢出6株細菌4種類型，分布在不動桿菌、無色桿菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌中。
　　結(jié)論：
　　1.入院患者糞便中攜帶一定量的碳青霉烯耐藥革蘭陰性桿菌，這些耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌分布于臨床常見致病菌中，甚至有臨床罕見菌，如C.gilardii，這些細菌可能定植于人類腸道糞便中，借助環(huán)境或其他因素進行傳播，對這些耐藥菌的監(jiān)測至關(guān)重要。
　　2.16S rRNA基因序列分析方法作為一種輔助鑒定臨床細菌的方法，可以

17、彌補傳統(tǒng)方法的局限而用于細菌的鑒定。本研究中BDPhoenix100全自動微生物鑒定儀難以準(zhǔn)確鑒定的細菌，其鑒定結(jié)果ID值小于90％或者無ID值，利用16SrDNA序列分析方法，能準(zhǔn)確闡明株細菌的屬種。通過對16S rDNA基因序列分析和BD Phoenix100全自動微生物分析儀鑒定結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)BD Phoenix100對某些非發(fā)酵菌鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。16SrRNA基因序列分析方法為細菌分類和鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.碳青霉烯酶基

18、因檢測碳青霉烯酶攜帶率高，IMP和VIM基因陽性菌株主要分布與假單胞菌屬中，也可見于腸桿菌科和部分非發(fā)酵菌，不動桿菌碳青霉烯酶基因以O(shè)XA型基因為主，對碳青霉烯酶基因的檢測有助于了解不同細菌的耐碳青霉烯機制。
　　4.整合子檢測出40種不同的基因盒，包括碳青霉烯酶基因盒，37種不同的基因盒排列，其中有7種為在所有屬種在首次報道，2種在相應(yīng)屬種中首次報道。ISCR檢測出9種不同的基因盒排列。復(fù)雜性整合子檢出4種不同類型。可移動基因元