住院患者糞便中耐碳青霉烯G-桿菌調(diào)查及耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究調(diào)查了住院患者糞便中的耐碳青霉烯G-細(xì)菌攜帶率，對(duì)耐碳青霉烯G-細(xì)菌進(jìn)行屬種鑒定和藥敏試驗(yàn)，并對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，檢測(cè)了常見的碳青霉烯酶基因，ESBL基因，及常見的耐藥基因轉(zhuǎn)移元件:整合子和ISCR，并進(jìn)一步對(duì)整合子和ISCR攜帶的耐藥基因盒進(jìn)行檢測(cè)和分析，闡明耐碳青霉烯G-細(xì)菌的耐藥機(jī)制，為臨床更好的防治提供信息。因產(chǎn)NDM超級(jí)細(xì)菌之前已經(jīng)做了相關(guān)研究，本研究主要針對(duì)余下的非產(chǎn)NDM耐碳青霉烯G-細(xì)菌展開。<

2、br>　　方法：
　　1.標(biāo)本收集收集南方醫(yī)院2013年7月至12月之間住院患者糞便標(biāo)本5000份。在含2 mg/l美羅培南麥康凱平板上培養(yǎng)分離耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌。并進(jìn)行分純、轉(zhuǎn)種和保存，用試劑盒提取細(xì)菌全基因組DNA。
　　2.菌株屬種鑒定及藥敏試驗(yàn)利用BD phoenix100全自動(dòng)微生物鑒定儀器對(duì)耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌進(jìn)行屬種鑒定和MIC藥敏試驗(yàn)。并同時(shí)用K-B紙片法法對(duì)亞胺培南和美羅培南的藥敏結(jié)果加以確認(rèn)。<

3、br>　　3.16S rRNA基因測(cè)序利用標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床常見菌株建立16S rRNA基因序列分析方法，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。利用這一方法對(duì)南方醫(yī)院三年來的臨床難鑒定細(xì)菌進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步擴(kuò)展到血培養(yǎng)標(biāo)本的應(yīng)用檢測(cè)。對(duì)糞便中分離的耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌擴(kuò)增16S rRNA基因并測(cè)序，經(jīng)過序列分析進(jìn)行其屬種的確認(rèn)，并與BD phoenix100的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。
　　4.常見碳青霉烯酶基因的檢測(cè) PCR檢測(cè)糞便中分離的耐碳青霉

4、烯的革蘭陰性桿菌的常見碳青霉烯酶基因KPC、VIM、IMP、SPM、GES、SIM、GIM、OXA-48基因，對(duì)于不動(dòng)桿菌加測(cè)OXA-23-1ike、OXA-24-1ike、OXA-51-like、OXA-58-1ike四群OXA類的碳青霉烯酶基因，將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證并確定其亞型。
　　5.ESBL基因的檢測(cè) PCR檢測(cè)糞便中分離的耐碳青霉烯的腸桿菌科細(xì)菌的常見ESBL基因TEM、SHV、CTX-M基因，將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物

5、進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證并確定其亞型。
　　6.Ⅰ類整合子及其基因盒檢測(cè) PCR先擴(kuò)增Ⅰ類整合子的保守區(qū)整合酶1基因，再對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增Ⅰ類整合子的可變區(qū)。根據(jù)限制性內(nèi)切酶HinfⅠ和RsaⅠ酶切可變區(qū)的圖譜對(duì)不同菌株的可變區(qū)初步分類，同一屬種不同的酶切譜型挑選2株進(jìn)行可變區(qū)測(cè)序，分析序列的同源性得出各可變區(qū)的耐藥基因盒組合。
　　7.ISCR及其基因盒檢測(cè)先利用PCR擴(kuò)增orf513基因，再對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增其攜帶的基因盒。根據(jù)

6、限制性內(nèi)切酶HinfⅠ和RsaⅠ酶切基因盒的圖譜對(duì)不同菌株的可變區(qū)初步分類，同一屬種不同的酶切譜型挑選2株進(jìn)行可變區(qū)測(cè)序，分析序列的同源性得出各可變區(qū)的耐藥基因盒組合。
　　8.復(fù)雜性整合子檢測(cè)根據(jù)復(fù)雜性整合子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)于Ⅰ類整合子可變區(qū)和ISCR1可變區(qū)同時(shí)陽(yáng)性的細(xì)菌，PCR擴(kuò)增兩者的串聯(lián)保守區(qū)，再對(duì)陽(yáng)性菌進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物檢測(cè)兩者的串聯(lián)可變區(qū)，再進(jìn)一步對(duì)串聯(lián)可變區(qū)測(cè)序，分析序列的同源性得出復(fù)雜性整合子耐藥基因盒組合。
　

7、　結(jié)果：
　　1.耐碳青霉烯細(xì)菌的分離和屬種分布從5000份糞便標(biāo)本中共篩查到389株耐碳青霉烯G-桿菌，包括58株腸桿菌科細(xì)菌和331株非發(fā)酵G-菌（含60株嗜麥芽窄食單胞菌，271株其他非天然耐碳青霉烯非發(fā)酵菌），其中96株為NDM陽(yáng)性菌株，其余293株細(xì)菌，包括36株腸桿菌科細(xì)菌和257株非發(fā)酵G-菌（含60株嗜麥芽窄食單胞菌，197株其他非天然耐碳青霉烯非發(fā)酵菌）。
　　2.細(xì)菌的藥敏結(jié)果BD phoenix100給

8、出了以下10種抗生素的MICs值，包括阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、粘菌素、復(fù)方新諾明、氯霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和四環(huán)素。根據(jù)CLSI文件M100-S23對(duì)細(xì)菌進(jìn)行藥敏結(jié)果判斷，非發(fā)酵菌和腸桿菌科細(xì)菌這兩組細(xì)菌對(duì)于上述這些藥物的敏感率不同。非發(fā)酵菌的敏感率分別為88.24％、25.82％、0、0、100.00％、26.89％、X、16.23％、45.76％、35.44％;而腸桿菌科的敏感率為56.36％、8.76％、0、0

9、、X、4.12％、25.69％、17.58％、29.72％、22.34％（X表示CLSI沒有相應(yīng)的藥敏參考折點(diǎn)）。K-B法檢測(cè)的IPM和MEM與儀器法藥敏結(jié)果一致。
　　3.16S rRNA基因序列分析方法的應(yīng)用建立16S rRNA基因序列分析方法，用于220株難鑒定細(xì)菌的屬種鑒定，其測(cè)序結(jié)果共分為45個(gè)種屬，其中8株為第一次在中國(guó)報(bào)道，2株為第一次在國(guó)際報(bào)道。100例血培養(yǎng)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)10例16S rDNA和儀器法鑒定結(jié)果不一致，

10、233株糞便分離的耐碳青霉烯G-桿菌中，27例非發(fā)酵菌的16S rDNA和儀器法鑒定結(jié)果不一致，以16SrDNA鑒定結(jié)果為準(zhǔn)，其他結(jié)果均一致。
　　4.碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果在233株耐碳青霉烯G-桿菌中共檢出IMP基因陽(yáng)性菌株41株，分3種亞型，IMP-1，IMP-4，IMP-9。VIM基因陽(yáng)性菌株31株，全部為VIM-2型。并有菌株同時(shí)攜帶IMP和VIM基因。IMP和VIM基因陽(yáng)性菌株主要分布與假單胞菌屬中，也可見于腸桿菌科和

11、部分非發(fā)酵菌。其余基因blaKPC、blaGIM、 blaSPM、blaSIM、bla GES、bla OXA-48均未檢出陽(yáng)性菌株。26株不動(dòng)桿菌的OXA基因檢測(cè)，20株含blaOXA-23、5株含blaOXA-24、19株含bla OXA-51、7株含blaOXA-58，同時(shí)有菌株同時(shí)攜帶多種OXA基因。
　　5.ESBL基因檢測(cè)結(jié)果36株耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌中，21株含blaTEM,16株含blaSHV，7株含blaCTX

12、-M，且有細(xì)菌同時(shí)攜帶兩種甚至三種ESBL基因。
　　6.Ⅰ類整合子及其基因盒檢測(cè)結(jié)果233株耐碳青霉烯細(xì)菌中Ⅰ類整合子陽(yáng)性135株，其中97株可變區(qū)陽(yáng)性菌株中共發(fā)現(xiàn)37種不同的基因盒排列組合。這37種基因盒組合中共包括40種不同的基因盒，分別是氨基糖苷類耐藥基因:aadA1，aadA2，aadA4,aadA5,aadA13,aadA24，aadB,aac(6')-Ⅱ,aacA4,aacA4-1ike，aacA6，aacA7;β-

13、內(nèi)酰胺酶耐藥基因:blaOXA-10，blaOXA-21，blaOXA-30，blaOXA-101，blaPSE-1，blaVIM-2，blaIMP-1，blaIMP-4，blaIMP-9;甲氧芐啶耐藥基因:dfrA1，dfrA5，dfrA12，dfrA14，dfrA15，dfrA17，dfrA25，dfrA27;氯霉素耐藥基因:cmlA1，cmlA8，catB2，catB8，catB-like;利福平耐藥基因arr-3。另外有四個(gè)基因

14、盒orfⅡ、orfⅢ、orfC、orfF尚未證實(shí)與耐藥基因有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)的37種不同的基因盒組合中，有7種排列為在所有細(xì)菌屬種首次報(bào)道，2種在相應(yīng)細(xì)菌屬種中首次報(bào)道。在1株陰溝腸桿菌中檢測(cè)到blaIMP-4基因盒，在惡臭假單胞菌、無色桿菌和1株Cupriavidus pauculus中檢測(cè)到blaIMP-1基因盒，在銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌中檢測(cè)到blaVIM-2基因盒。
　　7.ISCR及其基因盒檢測(cè)結(jié)果233株耐碳青霉烯細(xì)菌

15、中ISCR1陽(yáng)性93株，在41株可變區(qū)陽(yáng)性菌株中共發(fā)現(xiàn)9種不同的基因盒排列組合，這9種基因盒組合中包括不同的基因盒，分別是是氨基糖苷類耐藥基因:aadA2，aacA6;β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因:blaPER-1，bla CTX-M-9;甲氧芐啶耐藥基因:dfrA10，dfrA12，dfrA16;喹諾酮耐藥基因:qnrA1，qnrB2，qnrB6;利福平耐藥基因arr-3。
　　8.復(fù)雜性整合子檢測(cè)結(jié)果Ⅰ類整合子和ISCR1串聯(lián)形成的復(fù)

16、雜性整合子共檢出6株細(xì)菌4種類型，分布在不動(dòng)桿菌、無色桿菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌中。
　　結(jié)論：
　　1.入院患者糞便中攜帶一定量的碳青霉烯耐藥革蘭陰性桿菌，這些耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌分布于臨床常見致病菌中，甚至有臨床罕見菌，如C.gilardii，這些細(xì)菌可能定植于人類腸道糞便中，借助環(huán)境或其他因素進(jìn)行傳播，對(duì)這些耐藥菌的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。
　　2.16S rRNA基因序列分析方法作為一種輔助鑒定臨床細(xì)菌的方法，可以

17、彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的局限而用于細(xì)菌的鑒定。本研究中BDPhoenix100全自動(dòng)微生物鑒定儀難以準(zhǔn)確鑒定的細(xì)菌，其鑒定結(jié)果ID值小于90％或者無ID值，利用16SrDNA序列分析方法，能準(zhǔn)確闡明株細(xì)菌的屬種。通過對(duì)16S rDNA基因序列分析和BD Phoenix100全自動(dòng)微生物分析儀鑒定結(jié)果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)BD Phoenix100對(duì)某些非發(fā)酵菌鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。16SrRNA基因序列分析方法為細(xì)菌分類和鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.碳青霉烯酶基

18、因檢測(cè)碳青霉烯酶攜帶率高，IMP和VIM基因陽(yáng)性菌株主要分布與假單胞菌屬中，也可見于腸桿菌科和部分非發(fā)酵菌，不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因以O(shè)XA型基因?yàn)橹?，?duì)碳青霉烯酶基因的檢測(cè)有助于了解不同細(xì)菌的耐碳青霉烯機(jī)制。
　　4.整合子檢測(cè)出40種不同的基因盒，包括碳青霉烯酶基因盒，37種不同的基因盒排列，其中有7種為在所有屬種在首次報(bào)道，2種在相應(yīng)屬種中首次報(bào)道。ISCR檢測(cè)出9種不同的基因盒排列。復(fù)雜性整合子檢出4種不同類型。可移動(dòng)基因元