生長因子PGRN及其衍生工程蛋白Atsttrin在鈦離子誘導(dǎo)的骨溶解及骨關(guān)節(jié)炎中的作用.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)炎中的一種，是一種常見的慢性退化性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨破壞，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)丟失，關(guān)節(jié)滑膜炎癥產(chǎn)生，關(guān)節(jié)軟骨下骨硬化以及骨贅形成為主要特點。骨關(guān)節(jié)炎影響了世界15％的人口，然而卻沒有一種方法能有效的預(yù)防或治療骨關(guān)節(jié)炎?，F(xiàn)在市場上銷售的藥物多以緩解關(guān)節(jié)炎癥，降低疼痛為主要治療目的，卻沒有能從根本上改善或者治療骨關(guān)節(jié)炎。在本研究中，我們探索了生長因子progranulin的衍生的工程蛋白Atsttrin在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中的作用。

2、r>　　首先，我們發(fā)現(xiàn)作為progranulin的衍生工程蛋白，Atsttrin能夠緩解由于progranulin確失而引起的加重的骨關(guān)節(jié)炎。
　　其次，在手術(shù)誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，我們發(fā)現(xiàn)Atsttrin能有效預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨的丟失破壞。并且，Atsttrin能顯著降低在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中發(fā)生的滑膜炎。而且，Atsttrin能顯著減少軟骨下骨破骨細胞的生成，有效抑制軟骨下骨的骨丟失，以維持軟骨下骨的厚度。更重要的是，行為學(xué)檢查發(fā)

3、現(xiàn)局部注射Atsttrin能明顯降低骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)疼痛。更進一步，我們分離出背根神經(jīng)節(jié)進行基因檢測分析，發(fā)現(xiàn)Atsttrin在神經(jīng)節(jié)中能顯著降低炎癥相關(guān)性的疼痛因子的基因表達。
　　除了預(yù)防作用之外，我們發(fā)現(xiàn)Atsttrin在非侵入性骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，Atsttrin能有效治理骨關(guān)節(jié)炎。因為Atsttrin能夠和腫瘤壞死因子受體(TumorNecrosis Factor Receptors，TNFRs)特異性結(jié)合，為進一步明確At

4、sttrin發(fā)揮作用的機制，我們在野生型小鼠，腫瘤壞死因子受體1基因敲除(Tumor Necrosis FactorReceptors1 knockout，TNFR1-/-)鼠和腫瘤壞死因子受體2基因敲除(TumorNecrosis Factor Receptors2 knockout，TNFR2-/-)鼠中建立了手術(shù)誘導(dǎo)的前交叉韌帶離斷性骨關(guān)節(jié)炎模型，待骨關(guān)節(jié)炎成功誘導(dǎo)之后，我們局部注射Atsttrin。研究發(fā)現(xiàn)，在野生型小鼠中，At

5、sttrin能有效保護關(guān)節(jié)軟骨，在TNFR1基因敲除鼠中，Atsttrin仍有一部分保護作用，然而同野生型小鼠比較，保護作用相對減弱。相反的，在TNFR2基因敲出鼠中，Atsttrin介導(dǎo)的關(guān)節(jié)保護作用完全喪失了。因此，Atsttrin介導(dǎo)的保護作用依賴于TNFR1和TNFR2兩條信號通路。
　　為進一步明確在此過程中的分子機制，我們發(fā)現(xiàn)Atsttrin通過調(diào)節(jié)軟骨代謝來發(fā)揮其作用。首先，我們發(fā)現(xiàn)Atsttrin具有促進合成代謝的

6、作用。具體的說，Atsttrin能夠促進軟骨合成代謝的基因標(biāo)志物，如二型膠原，蛋白聚糖的表達。為探索Atsttrin激活的信號通路，我們采用雞尾酒信號通路篩選MAPK信號通路的改變，發(fā)現(xiàn)Atsttrin在人原代軟骨細胞中，能強烈并有效激活A(yù)kt信號通路，并且，Atsttrin能輕微激活Erk1/2信號通路，與此同時，其他信號通路，如S-6,P90等沒有明顯變化。為進一步明確這種激活是否具有特異性，我們分別或共同應(yīng)用Akt信號通路的抑制劑

7、Wortmannin，Erk1/2信號通路的抑制劑U0126來阻斷Akt，Erk1/2信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，分別應(yīng)用其信號抑制劑阻斷Akt信號通路或Erk1/2信號通路后，Atsttrin介導(dǎo)的二型膠原和蛋白聚糖的表達量顯著降低，當(dāng)同時阻斷Akt信號通路和Erk1/2信號通路后，Atsttrin介導(dǎo)的合成作用完全喪失了。此結(jié)果表明，Atsttrin介導(dǎo)的合成代謝作用依賴于Akt信號通路和Erk1/2兩條信號通路。為進一步明確哪一個受體在A

8、tsttrin介導(dǎo)的合成代謝中發(fā)揮作用，我們在野生型，TNFR1基因敲除鼠和TNFR2基因敲除鼠的膝關(guān)節(jié)中分離出原代的軟骨細胞，待細胞貼壁后，并予以Atsttrin刺激培養(yǎng)。實驗發(fā)現(xiàn)，Atsttrin介導(dǎo)的Akt信號通路和Erk1/2信號通路在野生型和TNFR1基因敲除鼠的軟骨細胞中正常激活，而這種激活作用在TNFR2基因敲除鼠中幾乎完全喪失了。更進一步的，在野生型和TNFR1基因敲除鼠的軟骨細胞中，Atsttrin能顯著促進二型膠原和

9、蛋白聚糖的基因表達，而在TNFR2基因敲出鼠中，Atsttrin幾乎不能促進二型膠原和蛋白聚糖的基因表達。綜上所訴，Atsttrin介導(dǎo)的軟骨合成作用依賴于TNFR2-Akt/Erk1/2信號通路。
　　除了合成作用，Atsttrin也有效抑制TNFα介導(dǎo)的分解代謝。因為TNFα在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中水平顯著升高，而且TNFα處在炎癥級聯(lián)反應(yīng)的頂端，前期研究表明，在多種動物模型中，通過阻斷TNFα信號通路可以改善骨關(guān)節(jié)炎，而且有二期

10、臨床試驗研究表明，TNFα抑制劑能夠顯著改善病人骨關(guān)節(jié)炎?？紤]到Atsttrin能特異性結(jié)合到TNFRs以及TNFα在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮的作用，為進一步研究是否Atsttrin能夠競爭性抑制TNFα介導(dǎo)的炎癥性分解代謝，我們采用人原代關(guān)節(jié)軟骨及軟骨細胞進行研究。首先，我們分離人的原代軟骨進行培養(yǎng)。Atsttrin能有效抑制TNFα介導(dǎo)的蛋白多糖的丟失。其次，我們分離軟骨細胞進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Atsttrin能顯著降低由TNFα誘導(dǎo)產(chǎn)生的分解代謝

11、標(biāo)志物的表達，如金屬蛋白酶MMP3,MMP13,ADAMTS-5以及炎癥標(biāo)志物NOS-2。為進一步了解其機制，我們將人的原代軟骨細胞進行不同培養(yǎng)之后，提取RNA，進行基因水平檢測，發(fā)現(xiàn)Atsttrin有效抑制TNFα誘導(dǎo)產(chǎn)生的前炎癥性因子的表達。
　　除此之外，眾所周知，TNFα在軟骨細胞中能激活MAPK及NF-KB信號通路，從而進一步激活各種下游炎性轉(zhuǎn)錄因子的表達，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞。在本實驗中，Atsttrin能夠有效抑制TNF

12、α介導(dǎo)的MAKP及NF-KB信號通路的激活，從而使炎癥性分解代謝標(biāo)志物如金屬蛋白酶MMP3,MMP13以及ADAMTS-5的表達明顯降低，同時炎癥標(biāo)志物NOS-2的表達也明顯降低。
　　TNFα/NF-KB是經(jīng)典的代謝通路。NF-KB有兩個亞基組成，分別為p50(IKB)和p65組成。在細胞未受刺激情況下，p50與p65在細胞核內(nèi)相互結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。細胞一旦受到TNFα刺激，NF-KB信號通路被激活。IKB磷酸化，釋放p65

13、,磷酸化的p65轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)內(nèi)，從而激活一系列下游炎癥性轉(zhuǎn)錄因子。本課題研究發(fā)現(xiàn)在人的原代軟骨細胞中，Atsttrin能強烈有效抑制NF-KB的磷酸化。而且，在動物骨關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)，Atsttrin能有效抑制IKB的磷酸化。同時，我們分別提取細胞質(zhì)和細胞核中的蛋白，并進行p65含量的免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)Atsttrin能有效抑制TNF介導(dǎo)的p65的核轉(zhuǎn)移。為進一步明確Atsttrin能否抑制NF-KB的活性，我們將具有熒光的N

14、F-KB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到軟骨細胞中，并進行培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，Atsttrin能顯著降低NF-KB的活性。綜上，Atsttrin能有效抑制TNFα介導(dǎo)的炎癥性分解代謝。
　　本實驗研究發(fā)現(xiàn)，Atsttrin能夠通過至少兩種路徑在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮保護作用:1）直接與TNFR2結(jié)合，激活A(yù)kt，Erk1/2信號通路，從而激活合成代謝;2)與TNFα競爭性結(jié)合TNFR1,拮抗TNFα介導(dǎo)的炎癥性分解代謝。此研究不僅提供了Atsttrin在關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)中