新鞘氨醇桿菌US6-1降解HMW-PAHs的代謝路徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(PAHs)是一類(lèi)在環(huán)境中廣泛分布的有機(jī)化學(xué)污染物，具有“三致”（致癌、致畸、致突變）效應(yīng)，通過(guò)食物鏈的傳遞會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害。目前研究結(jié)果表明，微生物的降解與轉(zhuǎn)化是消除PAHs污染的有效方式之一。以苯并芘(BaP)為代表的高分子量PAHs(HMW-PAHs)因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、難降解，可在環(huán)境中長(zhǎng)期存在。能以BaP為唯一碳源和能源進(jìn)行礦化的微生物研究報(bào)道較少，代謝路徑也不夠清楚。本論文以一株篩選自海洋環(huán)境的、高效的P

2、AHs降解菌NovosphingobiumpentaromativoransUS6-1為模式菌株，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和鏈特異轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，針對(duì)其對(duì)菲(Phe)、芘(Pyr)和苯并芘的降解特性，降解關(guān)鍵酶在不同PAHs誘導(dǎo)下的差異表達(dá)，質(zhì)粒pLA1在芳烴降解中的作用，以及在苯并芘脅迫條件下生理應(yīng)答過(guò)程等進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用GC/MS技術(shù)，檢測(cè)了新鞘氨醇桿菌US6-1對(duì)Phe、P

3、yr和BaP的降解能力，結(jié)果顯示:US6-1分別在24h，48h和6d培養(yǎng)后，對(duì)起始濃度為10ppm的菲、芘和苯并芘的降解率可達(dá)99.02％，52.88％和14.54％。說(shuō)明新鞘氨醇桿菌US6-1能以Phe、Pyr和BaP為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，在培養(yǎng)12h、48h和6d后已經(jīng)分別啟動(dòng)了對(duì)Phe、Pyr和BaP的降解;
　　2.對(duì)新鞘氨醇桿菌US6-1基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了兩條中心代謝路徑，分別為原兒茶酸代謝路徑和鄰苯二酚代謝路徑。

4、其中原兒茶酸代謝路徑的基因主要分布在在染色體上，而鄰苯二酚代謝路徑的關(guān)鍵基因主要分布在質(zhì)粒pLA1上。應(yīng)用SDS-變溫法得到了一株敲除質(zhì)粒pLA1的突變株CPUS6-1，比較US6-1和CPUS6-1在降解16種芳烴（苯并[a]芘、芘、菲、蒽酮、1-羥基-2萘甲酸、1-萘酚、2-萘酚、萘、水楊酸、鄰苯二酚、苯甲酸、龍膽酸、4-羥基苯甲酸、原兒茶酸、鄰苯二甲酸、間苯二酚）時(shí)的差異，證實(shí)了鄰苯二酚代謝路徑存在于質(zhì)粒pLA1上，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒

5、pLA1在芳烴降解中起著關(guān)鍵作用。我們還發(fā)現(xiàn)US6-1能降解龍膽酸，但是CPUS6-1卻不能降解，說(shuō)明有一條未知的龍膽酸代謝路徑存在于質(zhì)粒pLA1上，或者質(zhì)粒pLA1控制著龍膽酸降解路徑基因的表達(dá);
　　3.對(duì)新鞘氨醇桿菌US6-1的基因組中降解PAHs的功能基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)了17個(gè)具有環(huán)羥基化雙加氧酶(RHOs)保守結(jié)構(gòu)域的基因，經(jīng)過(guò)ClassRHO軟件分析后，17個(gè)RHOs中有7個(gè)得到了準(zhǔn)確分型。除RHOs外，對(duì)質(zhì)粒上

6、分布的其他降解基因及調(diào)控基因，在PAHs降解時(shí)mRNA水平上的表達(dá)差異進(jìn)行了跟蹤，結(jié)果顯示:RHOtypeⅠNSU_3626的表達(dá)量和未得到分型的RHONSU_PLA1141與其他兩種類(lèi)型的RHOs明顯不同，而其它基因的表達(dá)模式基本相同，均是在Phe和BaP降解條件下基因的表達(dá)量高于Pyr。
　　4.在以BaP為唯一碳源和不添加任何碳源的條件下，以細(xì)菌全局調(diào)控系統(tǒng)的關(guān)鍵基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，應(yīng)用鏈特異轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR

7、技術(shù)，跟蹤高分子量PAHs(BaP)脅迫下，US6-1在饑餓應(yīng)答、群體感應(yīng)以及啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡等應(yīng)急反應(yīng)過(guò)程中的基因表達(dá)差異，結(jié)果顯示:針對(duì)OD600、ETSA和CFU進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)新鞘氨醇桿菌US6-1在培養(yǎng)過(guò)程中，其OD600值變化不大，而CFU變化幅度較大，由此我們可以得出新鞘氨醇桿菌US6-1會(huì)從可培養(yǎng)狀態(tài)變?yōu)椴豢膳囵B(yǎng)狀態(tài)以適應(yīng)不適環(huán)境;針對(duì)降解路徑中的降解基因和應(yīng)急反應(yīng)調(diào)節(jié)基因進(jìn)行了相對(duì)基因表達(dá)含量測(cè)定，結(jié)果表明新鞘氨醇桿