GPMV F、HN及NP基因的多表達(dá)系統(tǒng)與DNA疫苗的研究.pdf

1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)博士學(xué)位論文泳分析證實(shí)NP基因獲得了表達(dá)，大小約為80ku：薄層掃描分析結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物占菌體蟹向的382％；經(jīng)Westenblot和Dot—ELISA分析證實(shí)表達(dá)的重組蛋白具有良好的抗原性，從而為鵝副粘病毒病的診斷奠定了必要的技術(shù)和物資基礎(chǔ)。將以上構(gòu)建的三種DNA疫苗轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時表達(dá)，結(jié)果在轉(zhuǎn)染后48h三種質(zhì)粒均獲得了表達(dá)，且表達(dá)的蛋白可與抗GPMV的抗體發(fā)生特異性結(jié)合。于熒光顯微鏡下可見黃綠色的熒光，而

2、質(zhì)粒pcDNA31及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞均未見熒光出現(xiàn)，呈陰性反應(yīng)。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明三種疫苗質(zhì)粒均能在體外獲得表達(dá)，從而為下一步的動物試驗(yàn)提供了必要的前提條件。為了評價所構(gòu)建的三種DNA疫苗的免疫效果，分別將它們以每只雞100ug的劑量分兩點(diǎn)肌肉注射接種3周齡的雞，同時以質(zhì)粒pcDNA3l和PBS以及油乳滅活苗作對照。3周后加強(qiáng)免疫，于加強(qiáng)免疫后2周以50LD50的GPMV肌肉注射攻毒(o2ml／只)，攻毒后每天觀察并詳細(xì)記錄雞只的

3、發(fā)病和死亡情況，并根據(jù)死亡數(shù)統(tǒng)計死亡率；各組免疫雞在首次免疫前、后(加強(qiáng)免疫前)、加強(qiáng)免疫后(攻毒前)及攻毒后1周分別采血，用H1和ELISA的方法檢測抗體的動態(tài)變化，同時檢測外周血CD4、CD8T淋巴細(xì)胞的動態(tài)變化。結(jié)果顯示：(1)攻毒前各DNA疫苗免疫組檢不到或只有很低的HI抗體，但攻毒后HN組的HI抗體效價迅速升高。(2)各DNA疫苗免疫組均不同程度的產(chǎn)生了ELISA抗體。(3)各DNA疫苗免疫組在免疫后外周血CD4、CD8T淋巴

4、細(xì)胞都有不同程度的升高。(4)攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示：油乳滅活苗組的雞全部得到保護(hù)，載體對照組于36天全部死亡，DNA疫苗免疫綱的保護(hù)率分別是：F組為40％(4／10)、HN組為30％(3／10)、NP組為50％(5／10)，且DNA疫苗免疫組雞的死亡時間遲于對照組。通過本研究證實(shí)，所構(gòu)建的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)雞體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對GPMV強(qiáng)毒的攻擊具有～定的保護(hù)作用。本研究成功的克隆了GPMVJS／1／97／Go分離株F、HN、

5、NP三段主要保護(hù)性抗原基因；利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含有F、HN及雙基因的重組禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體：對NP基岡進(jìn)行了原核表達(dá)和表達(dá)蛋白反應(yīng)原性的檢測；構(gòu)建了含有GPMVJS／1／97／Go分離株F、bIN、NP三種保護(hù)性抗原基因的DNA疫苗并進(jìn)行了體外瞬時表達(dá)和動物體內(nèi)接種試驗(yàn)?？傊ㄟ^本研究將為鵝副粘病毒病的診斷試劑和疫苗的研制提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，奠定良好技術(shù)基礎(chǔ)和物質(zhì)儲備。關(guān)鍵詞：鵝副粘病毒；F基因fIIN基因fNP基因；原核表選；重組