Subcellular proteomic approach for identifying signaling effectors PKC-β2 under high glucose in HUVEC.pdf

1、研究背景:
　　 隨著目前全球糖尿病的患病率不斷增加,糖尿病日益成為普遍而嚴重的公共衛(wèi)生問題,其特征性的血管并發(fā)癥是糖尿病患者致盲、致殘、致死的主要原因。在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中,內皮細胞功能紊亂被認為是重要的始動因素。近年來,大量研究顯示,蛋白激酶C(PKC)的激活可能是糖尿病血管病變重要的發(fā)病機制之一。在眾多的PKC亞型中,PKC-β2亞型在血管病變關鍵靶細胞—內皮細胞中優(yōu)勢表達,高糖應激介導的PKC-β2激活可能

2、是糖尿病血管病變重要病理生理鏈中的匯聚焦點和關鍵環(huán)節(jié)。然而既往的研究僅僅關注某一己知信號通路,針對PKC-β2亞型信號機制特征的全景式描述仍有待闡明。目前,在亞細胞水平,人們對于PKC亞型調節(jié)其下游分子間相互交聯(lián)作用的過程知之甚少。本文旨在探索高糖條件下內皮細胞亞細胞水平上與PKC-β2信號通路相關的新的潛在的效應子。
　　 目的和方法:
　　 為了對高糖條件下內皮細胞的亞細胞組分中與PKC-β2信號通路相關的新的潛在的

3、蛋白質進行分析鑒定,本實驗通過腺病毒載體轉染的方法構建了PKC-β2持續(xù)激活的人臍靜脈內皮細胞模型系統(tǒng),并將其置于高糖環(huán)境中培養(yǎng)。在隨后進行的二維(2-DE)凝膠電泳實驗中,共分4組處理細胞:正常葡萄糖對照組(NG,含5.6mmol/L D-葡萄糖);高糖組(HG,含25mmol/L D-葡萄糖);空載體對照組(EV,Ad5-Null轉染細胞后培養(yǎng)于25mmol/L的高糖培養(yǎng)基中);PKC-β2過表達組(PO,Ad5-PKC-β2轉染細

4、胞后培養(yǎng)于25mmol/L的高糖培養(yǎng)基中)。隨后采用經(jīng)典的亞細胞分離方法抽提細胞核、細胞質及其蛋白。運用包括二維(2-DE)凝膠電泳,質譜分析在內的蛋白組學研究策略對蛋白表達譜的變化進行分析。最后具有代表性的蛋白表達量的變化最終通過免疫印跡法得到證實。此外,我們通過運用BioGRID3.1生物相互作用數(shù)據(jù)庫,將蛋白組學實驗中得到差異表達蛋白用人類蛋白.蛋白相互作用的網(wǎng)絡聯(lián)系起來,網(wǎng)絡圖顯示了高糖條件下人臍靜脈內皮細胞中潛在的與PKC-β

5、2信號通路相關的蛋白的交聯(lián)作用。
　　 結果:
　　 (1)本實驗分別得到了人臍靜脈內皮細胞細胞核組分蛋白和細胞質組分蛋白的凝膠雙向電泳圖譜。在細胞核蛋白的雙相電泳圖譜中每組檢測到大約800個蛋白點,通過組內、組間的交叉匹配和比對,共發(fā)現(xiàn)38個點的蛋白表達量發(fā)生了顯著改變(±1.5倍,p＜0.05),并將它們定義為高糖誘導下的PKC-β2相關核蛋白。在細胞質組分蛋白的雙相電泳圖譜中每組中檢測到接近600個蛋白點,共發(fā)現(xiàn)2

6、8個點蛋白表達量發(fā)生了明顯改變(±1.5倍,p＜0.05)。(2)通過基質輔助激光解吸電離時間飛行質譜儀(MALDI-TOF MS)對以上蛋白表達量發(fā)生改變的蛋白點進行質譜分析及生物信息數(shù)據(jù)庫查詢,經(jīng)鑒定后篩選出50個差異表達蛋白,并這些差異蛋白分類如下:①生物合成和代謝相關蛋白;②蛋白激酶家族相關蛋白:③細胞周期,細胞凋亡和增殖相關蛋白;④轉錄因子相關蛋白。基于以上實驗結果,鑒定出了高糖條件下PKC-p2信號通路下游可能存在的多種新的

7、重要效應子:絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3),蛋白質DBF4同源蛋白B(DBF4B),細胞分裂周期蛋白7(CDC7),過氧化物酶增殖激活受體δ(PPARδ),核轉錄因子-kB抑制作用Ras樣蛋白(NKIRAS1),這些蛋白分別參與了糖脂對話,炎癥反應,細胞增殖,細胞周期等多個生物進程。(3)在己鑒定的蛋白質中,我們又對其中兩種蛋白:PPARδ、NKIRAS1用免疫印記法進行更加深入的驗證。結果顯示,PKC-β2持續(xù)激活下調了PPARδ

8、在細胞核中的蛋白量表達和下調了NKIRAS1在細胞質中的蛋白量表達。(4)此外,在這50個經(jīng)質譜鑒定的差異表達蛋白中,人類蛋白.蛋白相互作用網(wǎng)絡圖將其中14個蛋白成功聯(lián)系起來。
　　 結論:
　　 本研究首次運用亞細胞和功能蛋白質組學的方法,通過對比差異蛋白表達譜的變化,探討了高糖條件下內皮細胞的PKC-β2亞型下游效應子在亞細胞水平上的變化。我們發(fā)現(xiàn)了,PKC-β2可能通過調控PPARδ參與高糖環(huán)境下細胞內的糖脂對話。