來(lái)航雞FOXL2基因的真核表達(dá)及純化.pdf

1、FOXL2是第一個(gè)被認(rèn)定在維持卵巢功能方面發(fā)揮重要作用的人類常染色體基因，也是在脊椎動(dòng)物中最早被發(fā)現(xiàn)的卵巢分化的性別二態(tài)性標(biāo)記。FOXL2基因不但在抗擊卵泡凋亡、維持卵巢儲(chǔ)備功能方面發(fā)揮著重要作用，而且其正常表達(dá)與否可能與雞產(chǎn)蛋性能的高低有關(guān)。目前，隨著人們對(duì)FOXL2功能研究的逐漸深入，F(xiàn)OXL2蛋白的需求量也不斷增大，但是市場(chǎng)上現(xiàn)有的FOXL2產(chǎn)品存在少而貴的特點(diǎn)，不能很好的滿足于應(yīng)用?；诖瞬蛔?，本實(shí)驗(yàn)室曾采用大腸桿菌表達(dá)體系對(duì)來(lái)

2、航雞FOXL2基因進(jìn)行了表達(dá)，但蛋白量較少且活性低。故本研究利用酵母菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)來(lái)航雞FOXL2基因進(jìn)行真核表達(dá)及純化，以期獲得大量的高活性表達(dá)蛋白。
　　本研究根據(jù)GenBank上收錄的來(lái)航雞FOXL2的全基因序列（登錄號(hào)：JF＿708868.1），通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)分析其保守序列及真核表達(dá)載體的多克隆酶切位點(diǎn)，利用Primmer5.0來(lái)設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物P1、P2。以純系SPF來(lái)航雞全血DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的F

3、OXL2基因，并將其與pMD18-T載體連接，獲得重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-FOXL2。再以pMD18-T-FOXL2為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的FOXL2基因，定向克隆到真核表達(dá)載體pPICZaA中，構(gòu)建pPICZaA-FOXL2重組真核表達(dá)載體。用SacI將重組pPICZaA-FOXL2線性化后，電轉(zhuǎn)GS115畢赤酵母菌。28℃培養(yǎng)5d，PCR鑒定和測(cè)序正確后，進(jìn)行高拷貝子篩選，將篩選到的高拷貝轉(zhuǎn)化子加甲醇28℃誘導(dǎo)表達(dá)96

4、h。應(yīng)用SDS-PAGE和Western blot方法分析重組蛋白的表達(dá)情況，鑒定重組蛋白的抗原特異性，然后采用His鎳柱親和層析獲得重組蛋白的純化產(chǎn)物。
　　研究結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出來(lái)航雞FOXL2基因，經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析未發(fā)生氨基酸突變現(xiàn)象，成功構(gòu)建了重組克隆載體和表達(dá)載體。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌后經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，由于重組蛋白以胞外分泌的形式進(jìn)行表達(dá)，取上清SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)出與預(yù)期大小相一致的目的