preS1分子連接體轉(zhuǎn)運(yùn)siHBX抑制HepG2-HBX細(xì)胞株內(nèi)HBX基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乙型肝炎病毒感染是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題,慢性乙型肝炎常常發(fā)展為肝硬化、肝癌甚至肝衰竭。肝細(xì)胞肝癌(HCC)患者中乙型肝炎病毒(HBV)感染率高達(dá)50％～80%,其中HBX蛋白在HBV致癌過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。目前治療HBV感染主要采用干擾素及核酸類(lèi)似物,但存在副作用大、病毒變異逃逸等問(wèn)題,因此,新的治療手段和新藥開(kāi)發(fā)具有重要意義。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)作為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默手段已經(jīng)在

2、腫瘤、慢性疾病及感染性疾病的治療中顯示出巨大潛力及應(yīng)用前景;目前認(rèn)為siRNA臨床應(yīng)用中最主要的瓶頸在于其穩(wěn)定性較低并缺乏有效的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)策略。常用于轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA的系統(tǒng)主要有納米載體(nanocarrier)和分子連接體(molecular conjugate)兩類(lèi)。分子連接體多采用靶向性配體及穿透性多肽策略。
　　 HBV表面蛋白包含大蛋白(L)、中蛋白(M)、小蛋白(S),三者均具有S結(jié)構(gòu)域,M蛋白較S蛋白多出55個(gè)氨基酸的

3、preS2區(qū)域,而最外面的L蛋白較M蛋白又多出108或119個(gè)氨基酸的preS1區(qū)域。HBV侵入肝細(xì)胞的過(guò)程尚未徹底清楚,其特異性受體尚無(wú)明確結(jié)論。
　　 但相關(guān)的研究均表明preS1可能是病毒與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合并攜帶病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的配體;而preS1與受體結(jié)合的區(qū)域主要在其N(xiāo)端,其中21-47aa多肽片斷被證實(shí)起關(guān)鍵性作用。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)旨在成功構(gòu)建HepG2-HBX穩(wěn)定表達(dá)株的基礎(chǔ)上,驗(yàn)證preSl

4、連接體特異轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行RNA干擾的能力,為乙型肝炎病毒及肝癌的治療及預(yù)防提供新的探索。而目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道。
　　 方法:本課題以HBV病毒中的X基因?yàn)镽NA干擾對(duì)象;用脂質(zhì)體將含有HBX序列的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/HBX-Flag轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞系,通過(guò)G418篩選后分別經(jīng)RT-PCR和免疫組化,對(duì)HBX的穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證;化學(xué)合成靶向HBX的siRNA(即siHBX),用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)

5、入HepG2-HBX細(xì)胞株,分別以RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)HBX mRNA表達(dá)水平變化,Western Blot檢測(cè)HBX蛋白表達(dá)水平差異。在驗(yàn)證HBX穩(wěn)定表達(dá)及siHBX有效性的基礎(chǔ)上,化學(xué)合成pres1分子連接體,pres1分子連接體分別與肝細(xì)胞系與siRNA進(jìn)行結(jié)合能力試驗(yàn),然后以preS1分子連接體作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)染siHBX入HepG2-HBX后經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR及Western Blot檢測(cè)siHBX對(duì)H

6、BX基因的抑制效果。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染篩選試驗(yàn)結(jié)果顯示HBX轉(zhuǎn)染成功;進(jìn)一步的RT-PCR和免疫組化結(jié)果提示19號(hào)陽(yáng)性克隆高水平穩(wěn)定表達(dá)HBX基因。siHBX作用HepG2-HBX細(xì)胞系后36h和72h后對(duì)HBX mRNA的抑制率分別為85.37%±3.02%和58.05%±4.00%,而非特異性對(duì)照sirNA對(duì)HBXmRNA的抑制率分別2.11%±0.04%和1.02%±0.05%;免疫印跡實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞流式檢測(cè)驗(yàn)顯示siHBX能

7、夠抑制HBX蛋白及細(xì)胞周期進(jìn)展。
　　 進(jìn)一步凝膠電泳遷移試驗(yàn)(EMSA)證實(shí)preS1分子連接體能夠與siRNA進(jìn)行有效結(jié)合(摩爾比10:1),同時(shí)可以攜帶siRNA進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)高效抑制HepG2-HBX細(xì)胞株內(nèi)HBX的表達(dá)。與空白組相比,非特異陰性對(duì)照組抑制率為11.944±6.3%,而陽(yáng)性對(duì)照組(脂質(zhì)體)及實(shí)驗(yàn)組(preS1分子連接體)的抑制率分別為85.24±2.6%和77.80±6.10%。
　　 結(jié)論:上述結(jié)