小腸粘膜下層-蠶絲復(fù)合支架重建膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶的初步研究.pdf

1、目的：
　　在組織修復(fù)重建過程中，血管可以起到提供氧氣和營養(yǎng)、運(yùn)輸代謝產(chǎn)物的作用，因此移植物的早期血管化能力對組織修復(fù)意義重大。本研究欲采用富含細(xì)胞活性生長因子和Ⅰ型膠原并且體內(nèi)移植后具有促血管化能力的SIS與力學(xué)性能優(yōu)異的蠶絲支架結(jié)合，設(shè)計制備SIS-蠶絲復(fù)合支架，并評價復(fù)合支架的力學(xué)性能，生物相容性，以及體內(nèi)移植后是否具有促進(jìn)移植物早期血管化進(jìn)而提高重建效果的潛能。
　　方法：
　　1.蠶絲支架與SIS-蠶絲復(fù)合支

2、架制備
　　將天然蠶絲通過0.02m NaHCO3溶液處理，完全脫去絲膠。參考文獻(xiàn)，采用扭轉(zhuǎn)纜繩式設(shè)計，通過方程式模型模擬兔自體ACL的力學(xué)特性，用計算機(jī)蠶絲編織機(jī)編織符合兔自體ACL力學(xué)特性的蠶絲支架。將膜狀SIS呈圓筒狀包繞在蠶絲支架外圍構(gòu)建SIS-蠶絲復(fù)合支架。
　　2.支架力學(xué)性能評價及表面形貌觀察
　　通過生物力學(xué)測試儀評價支架的力學(xué)性能，通過掃描電鏡(SEM)觀察支架材料的表面形貌特征。
　　3.支架

3、材料細(xì)胞相容性評價
　　通過活死細(xì)胞染色法，觀察支架材料對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的影響。通過CCK-8法繪制生長曲線，評價支架材料浸提液對細(xì)胞生長的影響。
　　4.支架組織相容性評價及異位移植早期血管化能力評價
　　30只6周齡SD大鼠隨機(jī)分為兩組，蠶絲支架組（S組）與復(fù)合支架組(SS組)，分別將兩組支架材料移植大鼠皮下，2W、4W、8W取材行HE染色觀察，通過計數(shù)炎性細(xì)胞評價組織相容性，通過統(tǒng)計血管數(shù)目和觀察

4、支架新生血管的位置分布評價支架的促血管化能力。
　　5.兩支架對關(guān)節(jié)液滲入脛骨隧道影響的評價
　　20只新西蘭大白兔平均分為兩組，S組與SS組。行雙膝前交叉韌帶重建，術(shù)中脛骨隧道開窗，5ml10％NaCl和墨水溶液分別行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，不同時間點(diǎn)測量骨窗內(nèi)移植腱的電阻值并記錄骨窗處墨水滲出時間。
　　6.重建術(shù)后支架移植物表面血管化評價
　　用體式顯微鏡觀察重建術(shù)后4W,8W,12W韌帶移植物新鮮標(biāo)本在骨遂道內(nèi)口和

5、移植物中間段的血管分布情況，評價支架關(guān)節(jié)內(nèi)移植后表面早期血管化情況。
　　7.術(shù)后支架移植物韌帶化評價
　　重建術(shù)后4W，8W，12W，每組處死3只實驗動物，取移植物標(biāo)本行HE和Masson染色觀察，評價支架關(guān)節(jié)內(nèi)移植后韌帶化情況。
　　8.術(shù)后腱骨界面愈合的評價
　　術(shù)后4W,8W，12W，每組處死3只實驗動物，取股骨-韌帶移植物-脛骨復(fù)合體標(biāo)本，通過骨遂道m(xù)icro-CT掃描觀察，評估骨遂道內(nèi)鈣化物質(zhì)形成狀況

6、。掃描完成后標(biāo)本再通過固定，脫鈣處理，獲取骨與韌帶連接處，通過腱骨界面處HE組織學(xué)染色觀察，評價腱骨愈合情況。
　　9.術(shù)后移植物復(fù)合體力學(xué)測試
　　術(shù)后4W,8W,12W，取股骨-韌帶移植物-脛骨復(fù)合體標(biāo)本，通過生物力學(xué)測試機(jī)，測試復(fù)合體的力學(xué)性能，綜合評價術(shù)后移植物復(fù)合體的整體力學(xué)性能。
　　結(jié)果：
　　1.支架材料大體觀察
　　處理后獲得的SIS為白色富有彈性的膜狀材料。蠶絲支架為多股脫膠后蠶絲螺旋編

7、織而成。復(fù)合支架內(nèi)部為螺旋蠶絲束，外圍由SIS呈圓筒狀包繞。
　　2.支架力學(xué)性能評價及掃描電鏡觀察
　　蠶絲支架與復(fù)合支架最大載荷分別為138.62±11.41N，137.05±16.95N，剛度分別為(24.65±2.62)、（24.21±2.39）N·mm-1，形變量分別為9.40％、10.67％，差異比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。復(fù)合支架與兔自體韌帶的最大載荷匹配，分別為137.05±16.95 N與135.2

8、7±20.25 N，(P＞0.05)，但剛度有差別，分別為24.21±2.39N/mm與49±15.02N/mm，(P.＜0.05)。
　　SEM示未處理的蠶絲表面凹凸不平，覆蓋有大量絲膠。脫膠處理后蠶絲表面光滑，基本無絲膠附著。SIS表面膠原纖維縱橫交錯排列，膠原間形成大小不一的孔洞。構(gòu)建的復(fù)合支架中間為蠶絲支架，表面由三層膜狀SIS包繞而成。
　　3.支架材料細(xì)胞相容性評價
　　活死細(xì)胞染色示兩種支架材料上細(xì)胞形態(tài)

9、良好，外形輪廓清晰。其中復(fù)合支架上BMSCs伸展性更好，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。
　　細(xì)胞增殖曲線示3組A值均隨培養(yǎng)時間延長而升高，呈時間依賴性。各時間點(diǎn)A、B、C3組A值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.兩支架對關(guān)節(jié)液滲入脛骨隧道影響的評價
　　關(guān)節(jié)腔10％NaCl灌注后SS組電阻值開始下降的時間點(diǎn)明顯晚于S組(P＜0.05)，SS組電阻值擬合曲線的斜率明顯小于S組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.403，

10、P=0.016)。
　　關(guān)節(jié)腔內(nèi)墨水灌注后，SS組墨水未滲出時間及流注時間均較S組明顯增長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.支架組織相容性和體內(nèi)異位移植后促血管化能力評價
　　皮下埋植標(biāo)本HE染色示，術(shù)后兩組支架內(nèi)均出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，隨時間延長炎癥反應(yīng)明顯減緩，其中各時間點(diǎn)SS組炎性細(xì)胞數(shù)明顯少于S組(P＜0.05)。
　　術(shù)后2周SS組支架外緣的SIS開始降解，降解處可見較多新生血管，新生血管管腔

11、小，密度大。術(shù)后4周SS組中SIS大量降解，支架中間部分逐漸出現(xiàn)較多新生血管;術(shù)后8周血管遍布支架表面和內(nèi)部，血管變?yōu)楣芮淮蟮某墒煅?。而S組術(shù)后各時間點(diǎn)均未見明顯新生血管。術(shù)后各時間點(diǎn)兩組新生血管數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.重建術(shù)后支架移植物表面血管化評價
　　由體式顯微鏡觀察，術(shù)后4周時SS組移植物表面被明顯滑膜組織覆蓋，靠近骨隧道內(nèi)口處可見滑膜表面明顯的毛細(xì)血管網(wǎng)形成;術(shù)后8周時見滑膜內(nèi)有較成熟

12、的血管向移植物的中段延伸;術(shù)后12周時均可見管腔粗大的血管貫穿韌帶移植物表面。S組在術(shù)后4周支架表面未見有明顯血管出現(xiàn);術(shù)后8周時移植物表面僅有少量滑膜增生;術(shù)后12周時滑膜組織增多，滑膜表面僅有小血管出現(xiàn)。
　　7.重建術(shù)后支架移植物韌帶化評價
　　HE染色顯示:S組在術(shù)后4周時有大量炎性細(xì)胞浸潤，表面未見明顯滑膜組織;術(shù)后8周，蠶絲纖維表面有少量滑膜樣組織;術(shù)后12周時移植物結(jié)構(gòu)緊湊，表面滑膜組織增厚，仍未見明顯血管出現(xiàn)

13、。SS組術(shù)后4周，移植物結(jié)構(gòu)緊湊，有大量細(xì)胞浸潤。有三層結(jié)構(gòu):滑膜組織，未降解的層狀SIS，蠶絲纖維結(jié)構(gòu)。術(shù)后8周，三層結(jié)構(gòu)變?yōu)閮蓪咏Y(jié)構(gòu)，外層滑膜組織明顯增厚，滑膜中間彌漫大量新生血管，里層蠶絲纖維致密。術(shù)后12周，移植物層次界限模糊，結(jié)構(gòu)致密條理，類似自體韌帶樣組織。
　　Masson染色示:S組在術(shù)后4周時，僅見大量蠶絲纖維，未見明顯的膠原纖維;8周時支架中出現(xiàn)稀疏雜亂的膠原纖維;12周時膠原纖維密度增大，但分散、排列不規(guī)整。

14、SS組在術(shù)后4周時，支架表面有較厚的膠原層，支架內(nèi)部出現(xiàn)稀疏雜亂的膠原纖維;術(shù)后8周時，支架內(nèi)部出現(xiàn)濃密、排列較規(guī)整的膠原纖維，膠原纖維直徑較小;術(shù)后12周時，支架的層次分界變模糊，內(nèi)部彌漫大量較成熟且分布致密、排列規(guī)則的膠原纖維。
　　8.術(shù)后腱骨界面愈合評價
　　8.1組織學(xué)評價
　　HE染色示，S組在術(shù)后4周時移植物與骨隧道壁之間連接較少;術(shù)后8周時界面由肉芽組織填充;術(shù)后12周時界面組織中出現(xiàn)致密的纖維連接，沿

15、界面垂直排列，類似sharpey樣纖維。SS組在術(shù)后4周時，移植物與骨隧道壁之間由致密的肉芽組織填充，中間彌漫大量細(xì)胞和新生毛細(xì)血管;術(shù)后8周時界面中出現(xiàn)濃厚致密的纖維連接，纖維排列規(guī)則，沿界面垂直方向排列;術(shù)后12周時腱骨界面層次模糊，骨隧道壁出現(xiàn)大量成骨細(xì)胞，界面中出現(xiàn)軟骨細(xì)胞，類似不成熟的腱骨軟骨過渡區(qū)。
　　8.2 micro-CT掃描結(jié)果
　　通過分析可知，在重建4周后，SS組與S組骨隧道內(nèi)均未見明顯鈣化組織沉積，

16、在重建后12周，兩組骨隧道半徑未擴(kuò)大，但骨隧道內(nèi)仍然未見明顯鈣化信號。術(shù)后4周與12周，骨隧道面積沒有明顯增大。
　　9.術(shù)后移植物力學(xué)評價
　　SS組與S組樣本損毀模式差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　術(shù)后4周時，SS組與S組的最大載荷和剛度分別為(40±12.03)、（30±7.91）N和（6.90±1.14）、（5.98±0.81）N/mm，最大載荷與剛度兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　

17、術(shù)后8周時，SS組的最大載荷與剛度均強(qiáng)于S組，最大載荷分別為（45.20±8.44）、(20.20±4.76)N，剛度分別為(5.02±0.84)、(3.36±0.96) N/mm，兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　術(shù)后12周時，SS組的最大載荷與剛度均強(qiáng)于S組，最大載荷分別為（58±5.70）、(30.6±6.84)N，剛度為（8.12±0.60）、(3.96±0.86) N/mm，兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0