赭曲霉毒素A模擬表位二級庫的構建及其全抗原的生物合成.pdf

1、赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是一種由真菌代謝產(chǎn)生的有毒化合物。OTA通過受污染的食物和飼料進入人和動物體內(nèi),導致急性或慢性中毒。為了降低OTA對人類和動物的危害風險,國內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展出眾多類型的檢測方法。其中以簡單、快速、高特異性的免疫分析法應用最為廣泛。
　　然而,在免疫學檢測過程中使用的真菌毒素可能危害檢測人員的身體健康。而且,價格昂貴的真菌毒素標準品也在一定程度上限制了免疫學檢測的應用。此外,真菌

2、毒素全抗原的人工合成方法存在批間差異大的缺陷。因此,人們試圖開發(fā)一些能夠代替人工抗原的檢測材料,而模擬表位正是其中一種。
　　模擬表位能夠模擬抗原表位與抗體之間的相互作用,主要來源于噬菌體展示隨機肽庫。但是從隨機肽庫中淘選獲得的模擬表位受到原始肽庫多樣性的限制,不一定能達到建立高靈敏度檢測方法的要求。因此本研究通過構建噬菌體展示二級肽庫,對原始的OTA模擬表位進行體外進化,再以此建立OTA的免疫檢測方法,達到提高靈敏度之目的。最后

3、,再利用基因工程技術以及蛋白質(zhì)工程技術,實現(xiàn)OTA全抗原的生物合成,并以其建立免疫學檢測方法。主要研究內(nèi)容和結果概括如下:
　　1、OTA噬菌體展示模擬表位的淘選
　　為獲得OTA的模擬表位,首先以抗OTA單克隆抗體為靶分子,在商業(yè)噬菌體展示十二肽庫和環(huán)七肽庫中進行淘選。經(jīng)過三輪親和淘選以及ELISA鑒定,獲得7個展示OTA模擬表位的噬菌體。通過比對這些模擬表位的多肽序列,發(fā)現(xiàn)其中4個模擬表位含有FQLH序列,因此推斷FQL

4、H可能為OTA模擬表位的保守序列,并且以此應用于噬菌體展示二級肽庫的構建。
　　2、噬菌體展示二級肽庫的構建與篩選
　　將保守序列 FQLH固定于模擬表位的中間位置,在其兩端分別引入3個隨機的氨基酸殘基,構建噬菌體展示二級肽庫。該噬菌體展示肽庫的庫容量為1.2×108 pfu,理論上包含了所有可能存在的氨基酸序列(6.4×107)。通過嚴格控制淘選條件,能夠改善噬菌體展示模擬表位與抗OTA單克隆抗體的結合性能。經(jīng)ELISA鑒

5、定,噬菌體展示 OTA模擬表位的半抑制濃度( half inhibition concentration, IC50)值從原來的0.50-1.03 ng/mL降低至0.052-0.336 ng/mL。
　　3、基于OTA噬菌體模擬表位免疫分析方法的建立
　　以噬菌體展示的OTA模擬表位取代人工抗原,建立化學發(fā)光ELISA和膜基質(zhì)免疫分析法?；瘜W發(fā)光ELISA的IC50為0.04 ng/mL,線性范圍為0.006-0.245

6、ng/mL;膜基質(zhì)免疫分析法的閾值設定為1 ng/mL。分別采用這兩種方法檢測40份食品及飼料樣品,并將測定數(shù)據(jù)與商業(yè)ELISA試劑盒進行比較,結果顯示三者的相關性良好。
　　4、OTA全抗原的生物合成及其在免疫分析中的應用
　　將OTA模擬表位的編碼基因克隆至pMAL-pIII表達載體并轉入大腸桿菌進行表達,獲得OTA模擬表位與 MBP蛋白融合表達的產(chǎn)物,即生物合成抗原,并將其應用于化學發(fā)光ELISA和膜基質(zhì)免疫分析法?；?/p>