索拉膠降解菌產(chǎn)葡聚糖酶的研究.pdf

1、β-葡聚糖酶水解谷物及真菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，在多個(gè)領(lǐng)域尤其是飼養(yǎng)業(yè)和發(fā)酵工業(yè)中具有極大應(yīng)用價(jià)值。索拉膠(Salecan)是由土壤桿菌ZX09分泌的一種新型的水溶性線性β-1，3-葡聚糖，具有多種生理活性。索拉膠多糖分子量高達(dá)2×106 Da，溶液粘度較高，使得索拉膠在生理活性研究及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。利用索拉膠作為多糖降解菌的篩選底物，一方面可獲得葡聚糖酶及其產(chǎn)生菌;另一方面可獲得水解索拉膠的高效酶源。該研究對(duì)于進(jìn)一步挖掘新型葡

2、聚糖酶，以及制備和研究具有生物活性的新型β-1，3-葡聚寡糖都有著非常重要的意義。
　　通過(guò)觀察粘度下降和CTAB-透明圈的形成情況，分離到一株索拉膠降解菌株S09。S09菌好氧，細(xì)胞為桿狀，革蘭氏染色陰性，可利用的碳源包括淀粉、茯苓聚糖、昆布多糖、燕麥粉、酵母葡聚糖、黃原膠和索拉膠，不能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、纖維素和木聚糖。S09菌具有耐鹽性，能在含7.0％NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。16S rDNA同源性分析鑒定該菌為類芽孢桿菌

3、(Paenibacillus sp.S09)。S09能分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶、β-1，3-葡聚糖酶和索拉膠水解酶。
　　通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，對(duì)S09菌產(chǎn)索拉膠水解酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基（Hty）組成為:索拉膠7.0 g，尿素0.7g，磷酸二氫鉀0.5g，無(wú)水氯化鈣0.1g，七水合硫酸鎂0.15g，七水合硫酸亞鐵0.015g，氯化鋅0.0025g，水1000mL，pH7.9。接種量為4％時(shí)，35℃下發(fā)酵3

4、0h，發(fā)酵上清液中索拉膠水解酶酶活達(dá)到15.2U/mL。1％(w/v)的索拉膠溶液中添加1％(v/v)的粗酶液后孵育，10min內(nèi)能使粘度急劇下降至水樣狀態(tài)，同時(shí)伴隨大量還原糖的生成。
　　從S09菌基因組文庫(kù)中篩選到β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因plicA，全長(zhǎng)為717 bp，編碼238個(gè)氨基酸，N端1-26個(gè)殘基組成信號(hào)肽。將去除信號(hào)肽基因序列的plicA構(gòu)建到pET29a上，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)中重組表達(dá)。

5、鎳柱純化后測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)，最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和6.2。以大麥β-葡聚糖為底物，重組PlicA酶比酶活為7055U/mg，米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax值分別為3.7 mg/mL和3333.3μmol min-1 mg-1。PlicA酶可耐受pH范圍為pH3.5～12.0，具有酸和堿穩(wěn)定性。PlicA酶可耐受4MNaCl，孵育24h后保持至少90％的活性;0.5M的NaCl可將提高酶活力到1.5倍;具有耐鹽性或鹽激活性。Pl

6、icA酶是第一例同時(shí)具有耐酸、耐堿和耐鹽特性，及高催化活性的細(xì)菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶。
　　通過(guò)簡(jiǎn)并PCR、反向PCR和SEFA-PCR，從S09菌基因組中克隆到β-1，3-葡聚糖酶基因pglA，全長(zhǎng)2631 bp，編碼876個(gè)氨基酸。PglA酶N端1-38個(gè)殘基為信號(hào)肽序列。PglA酶為多區(qū)域酶，包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域:N端域、GH16催化域和C端Ig-like域。截短表達(dá)試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個(gè)PglA酶的截短衍生物rPglAΔC，rPg

7、lAΔN，rPglA-CD，rPglA-N和rPglA-C。四個(gè)含催化域的酶rPglA、rPglAΔC、rPglAΔN和rPglA-CD的最適反應(yīng)溫度分別為60℃、60℃、50℃、60℃;最適反應(yīng)pH分別為5.5、6.5、5.5、6.0。C端結(jié)構(gòu)域的去除提高酶的最適反應(yīng)溫度。rPglA-CD酶熱穩(wěn)定性最高，其次為rPglAΔC，C端結(jié)構(gòu)域的去除明顯提高了酶的熱穩(wěn)定性。PglA酶專一性水解β-1，3-葡聚糖，N端或C端域可提高酶對(duì)不溶性糖

8、的催化活性，并可提高酶對(duì)底物的親和力和催化效率。N端或C端域?qū)Ｒ恍越Y(jié)合β-1，3-葡聚糖底物，屬于碳水化合物結(jié)合域(CBMs)。該結(jié)果揭示了β-1，3-葡聚糖酶C端Ig-like域?qū)γ富钚院头€(wěn)定性的影響。
　　采用硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析，純化了類芽孢桿菌S09胞外索拉膠水解酶SalA。SalA酶是分子量為170 kDa的糖蛋白，糖含量為18.5％。經(jīng)質(zhì)譜鑒定和de novo測(cè)序獲得7條肽段序列。通過(guò)簡(jiǎn)并PCR和SE

9、FA-PCR獲知SalA酶基因序列。salA基因全長(zhǎng)4374 bp，編碼1457個(gè)氨基酸，N端1-32個(gè)殘基組成信號(hào)肽。SalA酶為多區(qū)域酶，從N端至C端，依次為右手β-螺旋催化域(Beta helix)，碳水化合物結(jié)構(gòu)域4或9家族(CBM_4_9)，F(xiàn)5/8C結(jié)構(gòu)域（F5/8 type C）、細(xì)菌免疫球蛋白相似域(Big_2)和兩個(gè)非典型糖類結(jié)合域(Sugar binding)。SalA酶專一性水解索拉膠多糖，最適反應(yīng)溫度和pH分別為

10、70℃和pH6.0，具有耐溫性(65℃)和酸堿穩(wěn)定性(pH3.0～10.0)，酶活力為251.1 U/mg，Km和Vmax值分別為11.1 mg/mL和833.3μmol min-1 mg-1。SalA酶是第一個(gè)進(jìn)行分離和研究的新型索拉膠水解酶。
　　SalA酶水解索拉膠多糖的終產(chǎn)物為分子量和結(jié)構(gòu)均一的索拉膠寡糖(S08)，電噴霧質(zhì)譜測(cè)定其分子量為1484 Da，1H和13C核磁共振分析其糖鏈結(jié)構(gòu)為:α-D-Glcp-(1→3)-

11、[β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→3)]3-D-Glcp。通過(guò)與索拉膠多糖的NMR圖譜比較，判斷是S08兩端的葡萄糖殘基上均攜帶一個(gè)甲基和一個(gè)羧丙基。SalA酶專一性地作用于索拉膠多糖底物中兩個(gè)α-葡萄糖殘基之間的α-1，3-糖苷鍵，屬于一種新型α-1，3-葡聚糖酶。索拉膠寡糖可清除DPPH自由基，具有體外抗氧化活性。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)表明索拉膠寡糖對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠具有恢復(fù)作用，可升高脾臟指數(shù)和白細(xì)胞數(shù)目至正常水